部分杧果種質資源遺傳多樣性的SRAP和ISSR分析

張 宇，黃國弟，黃 強

(廣西壯族自治區亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001)

部分杧果種質資源遺傳多樣性的SRAP和ISSR分析

張 宇，黃國弟，黃 強

(廣西壯族自治區亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001)

利用SRAP和ISSR分子標記，對20份杧果種質資源進行遺傳親緣關系分析，為杧果種質資源的鑒定和雜交育種親本選配提供參考依據。結果顯示，在SRAP分析中，從80對引物中選出12對引物組合共擴增出224條譜帶，每對引物組合擴增譜帶數在13～21條，平均為18.7條，其中多態性譜帶為194條，平均多態性譜帶為16.2條，多態性比率為86.61 %，材料間相似遺傳系數變化范圍為0.54～0.94；在ISSR分析中，從100條引物中選出10條引物共擴增出179條譜帶，每條引物擴增譜帶數在11～20條，平均為17.9條，其中多態性譜帶為153條，平均多態性譜帶為15.3，多態性比率為85.35 %，材料間相似遺傳系數變化范圍為0.58～0.90。SRAP和ISSR標記分別在相似系數0.624和0.665水平上，均可將20份杧果種質資源分成4大類群，SRAP和ISSR標記都能將供試材料完全區分開來，聚類結果具有很高的一致性，均適用于杧果材料的遺傳多樣性分析，可用于杧果遺傳親緣關系的研究。

杧果；遺傳多樣性；SRAP；TRAP

杧果(MangiferaindicaLinnaeus.)屬漆樹科(Anacardiaceae)杧果屬(MangiferaLinnaeus)多年生常綠果樹，是與番荔枝、榴蓮、香蕉、菠蘿齊名的熱帶名果[1]。杧果產業的發展依賴于杧果新品種的推陳出新。20世紀90年代，基于DNA水平的多種分子標記技術相繼出現，這些技術以其多態性豐富、數量多、不受環境影響等特點，為實現對植物基因型的選擇提供了有力的工具，受到遺傳育種學家的高度重視。分子標記技術的出現加速了杧果遺傳育種的發展。盡管AFLP[2-3]、RAPD[4-6]、SSR[7-8]等標記技術在杧果的遺傳多樣性分析、DNA指紋圖譜構建、品種鑒定等方面已有一些應用，但與蘋果[9-10]、梨[11-12]等大宗果樹相比，分子標記技術在杧果上的研究相對起步較晚、應用較為薄弱。SRAP[13]標記技術多用于杧果功能基因的定位，ISSR[14-16]標記技術應用于杧果親緣關系鑒定和遺傳規律分析的報道最多，但將兩種標記結合起來用于杧果遺傳多樣性的研究鮮見報道。為此，本研究借助SRAP和ISSR分子標記技術，以廣西亞熱帶作物研究所杧果種質資源圃內的杧果種質資源為材料，進行遺傳多樣性分析和評價，旨在明確杧果遺傳多樣性和親緣關系情況，為今后杧果品種鑒別、雜交育種親本選配、遺傳關系及遺傳多樣性分析提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的20份杧果種質資源均種植于廣西亞熱帶作物研究所杧果種質資源圃(表1)。

1.2 研究方法

1.2.1 總DNA的提取和濃度測定 參考張宇等[17]的改良CTAB法提取DNA，用紫外分光光度計和1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量和濃度，將提取的DNA稀釋為30 ng/μl，放入-20 ℃保存備用。

1.2.2 SRAP和ISSR反應體系的建立及優化 參考趙英等[18]和應東山等[19]發表的SRAP反應體系，利用正交優化法，優化PCR擴增體系為20 μl，包括25 mmol/L MgCl22 μl、10×PCR緩沖液 2 μl、10 mmol/L dNTP 0.5 μl、5 U/μlTaq酶 0.3 μl、30 ng/L模板DNA 3 μl、0.1 μmol/L上下游引物(表2)各2.5 μl、滅菌雙蒸水1.2 μl，加5 μl石蠟進行擴增。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，(退火溫度因引物不同而不同)退火1 min，72 ℃延伸2 min，5個循環；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

參考筆者之前的ISSR反應體系，利用正交優化法，優化PCR擴增體系為20 μl，包括25 mmol/L MgCl22 μl、10×PCR緩沖液3 μl、10 mmol/L dNTP 0.5 μl、5 U/μlTaq酶0.5 μl、30 ng/L模板DNA 1 μl、0.1 μmol/L引物1 μl、滅菌雙蒸水12.0 μl，加5 μl石蠟進行擴增。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，(退火溫度因引物不同而不同)退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.3 SRAP和ISSR引物篩選 SRAP引物設計參考Li等[14]所用引物，設計5條正向引物和7條反向引物，共計35對引物組合，由上海生物工程股份有限公司合成。ISSR引物設計選擇加拿大哥倫比亞大學(University of British Columbia,UBC)公布的100條引物，同樣由上海生物工程股份有限公司合成。以桂熱杧82號、桂熱杧71號、紫花杧、金煌杧、金穗杧為模板，篩選出SRAP和ISSR引物(表2)。

表1 材料名稱與來源地

注：M：多胚，P：單胚。

Note:M：Monoembryonic，P：Polyembryonic.

1.2.4 電泳檢測 取8 μl擴增產物在2 %的瓊脂糖電泳分離，電壓為5 V/cm，電極緩沖液為0.5×TBE，電泳結束后用熒光核酸染料染色，在紫外分析儀上觀察并照相。

1.2.5 數據分析 根據分子標記的遷移率及其有無，統計所有的二元數據。按條帶有無賦值，有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”，記錄清晰、穩定的擴增帶輸入Excel 2007建立原始數據矩陣。應用NTSYS(version2.10)軟件進行數據處理，采用非加權類平均法(UPGMA)進行聚類分析，得到遺傳相似系數建立聚類分析樹狀圖[20]。

2 結果與分析

2.1 SRAP和ISSR擴增多態性比較

設計正向引物5條，反向引物7條，共計12個引物組合。交由上海生物工程技術服務有限公司合成，為了得到有效的SRAP分子標記，此12對引物組合可以擴增出條帶清晰、重復性好，多態性豐富的DNA電泳多態性譜帶。進行SRAP擴增及數據分析，利用12對引物組合對20份杧果種質資源進行擴增，共產生224條清晰條帶(圖1)，平均每對引物擴增出18.7條，其中多態性譜帶為196條，平均多態性譜帶16.2條，多態性比率為86.61 %(表3)。選擇加拿大哥倫比亞大學(University of British Columbia,UBC)公布的引物，進行序列設計與合成，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，為了得到有效的ISSR分子標記，對已合成的100條引物進行篩選，選出10條擴增清晰、重復性好，多態性豐富的引物，進行ISSR擴增及數據分析。利用10條引物對20份杧果種質資源進行擴增，共產生179條清晰譜帶(圖2)，平均每個引物產生17.9條譜帶，其中多態性譜帶為153條，平均多態性譜帶15.3條，多態性比率為85.35 %(表3)。比較SRAP和ISSR擴增的總條帶數和多態性譜帶比率，SRAP標記多態性高于ISSR標記。

表2 SRAP和ISSR引物序列

表3 SRAP和ISSR擴增結果

經2 %瓊脂糖凝膠電泳，并用紫外分析儀拍照可得SRAP和ISSR電泳圖譜(圖1和圖2)。36對SRAP引物組合中，12對引物組合可以擴增出清晰、穩定、多態性高的DNA譜帶，譜帶分子量在100 ～2000 bp；100條ISSR引物中，10條引物可以擴增出清晰、穩定、多態性高的DNA譜帶，譜帶分子量在250 ～2000 bp。SRAP和ISSR標記均能擴增出符合研究預期效果的DNA多態性譜帶，SRAP標記擴增譜帶清晰度、層次感較ISSR標記擴增效果好，SRAP標記從較少的待選引物中篩選出較多的滿足研究要求的引物，且SRAP標記擴增譜帶分布范圍較ISSR標記廣。比較分析SRAP和ISSR標記擴增電泳圖譜，杧果種質資源具有較高的SRAP多態位點。

M:DL2000 bp ladder;編號1～20同表1，下同M:2000 bp ladder;Code 1-20 are the same as the table 1.The same as below圖1 SRAP引物組合Me3/Em14的擴增電泳圖Fig.1 SRAP amplification profile of prime combination Me3/Em14

圖2 ISSR引物UBC857的擴增電泳圖Fig.2 ISSR amplification profile of prime UBC857

2.2 SRAP和ISSR聚類分析比較

利用UPGMA法對SRAP標記擴增結果進行聚類樹狀圖構建(圖3)。在遺傳相似系數0.624處可將20份杧果供試材料分為4組，依次標記A、B、C、D。興熱1號在A組；虎豹牙、金煌杧在B組；云霞杧、粉紅杧、沅江象牙杧、桂熱杧82號在C組；象牙22、紫花杧、紅蘋杧、金穗杧、紅玉杧、三蜜杧、桂熱杧71號、楊杧、碩帥杧、矮杧、攀西紅杧、白象牙、龍眼香杧在D組。在遺傳相似系數0.665處B組分為B1和B2 2個亞組，金煌杧在B1組，虎豹牙在B2組；在遺傳相似系數0.679處C組分為C1和C2 2個亞組，云霞杧、沅江象牙杧、桂熱杧82號在C1組，紅粉杧在C2組；在遺傳相似系數0.662處D組分為D1和D2 2個亞組，象牙22、紫花杧、紅蘋杧、金穗杧、紅玉杧、三蜜杧在D1組，桂熱杧71號、楊杧、碩帥杧、矮杧、攀西紅杧、白象牙、龍眼香杧在D2組。

按UPGMA法構建ISSR標記親緣關系樹狀圖(圖4)。在遺傳相似系數為0.665的水平上，將20份杧果供試材料分為4組，分別用A、B、C、D依次標記。興熱1號在A組；虎豹牙、金煌杧在B組；云霞杧、粉紅杧、沅江象牙杧、桂熱杧82號、象牙22、紫花杧、紅蘋杧在C組；金穗杧、紅玉杧、三蜜杧、桂熱杧71號、楊杧、碩帥杧、矮杧、攀西紅杧、白象牙、龍眼香杧在D組。在遺傳相似系數0.711處B組分為B1和B2 2個亞組，虎豹牙在B1組，金煌杧在B2組；在遺傳相似系數0.728處C組分為C1和C2 2個亞組，云霞杧、沅江象牙杧在C1組，紅粉杧、桂熱杧82號、象牙22、紫花杧、紅蘋杧在C2組；在遺傳相似系數0.739處D組分為D1和D2 2個亞組，紅玉杧、三蜜杧、桂熱杧71號在D1組，金穗杧、楊杧、碩帥杧、攀西紅杧、白象牙、龍眼香杧在D2組。基于遺傳相似系數的不同(圖3～4)，利用UPGMA法對供試的20份杧果種質資源進行聚類分析，SRAP和ISSR 2種標記獲得了相似但不完全相同的聚類樹狀圖。

圖3 基于SRAP標記遺傳相似系數UPGMA聚類圖Fig.3 Dendrogram generated by UPGMA methods based on genetic similarity from SRAP marker

圖4 基于ISSR標記遺傳相似系數UPGMA聚類圖Fig.4 Dendrogram generated by UPGMA methods based on genetic similarity from ISSR marker

3 討論與結論

3.1 SRAP和ISSR遺傳多樣性比較分析

杧果遺傳多樣性研究是杧果育種的重要環節[21]。運用分子標記技術研究杧果種質資源的遺傳多樣性，可以不受環境、時間、空間的限制，從基因組水平上揭示其遺傳差異。ISSR標記技術是在SSR序列的5′或3′端錨定2～4個堿基為引物，降低其他可能靶標退火的數目。此方法的優勢是在基因組上只有與錨定的堿基匹配的位點才能被靶定，規避了引物在基因組上的脫落，加大PCR擴增反應的確定性，ISSR標記是顯性標記；引物設計是SRAP標記的核心，SRAP標記引物為雙引物，在正向引物使用“CCGG”序列，結合可譯框(ORFs)區域的外顯子，但外顯子通常具有保守特性，低水平的多態性限制了它們做標記的條件，內含子具有變異性大特點，堿基AT區域通常見于內含子中，SRAP標記反向引物的3′端含有核心AATT，以特異結合富含AT堿基區域，因此該標記可以擴增出基于內含子與外顯子的SRAP多態性。本研究表明：SRAP擴增電泳對20份杧果種質資源共產生224條有效譜帶，平均每對引物組合擴增出18.7條，其中多態性譜帶為196條，平均多態性譜帶16.2條，多態性比率為86.61 %；ISSR擴增電泳對20份杧果種質資源共產生有效譜帶179條，平均每條引物產生譜帶17.9條，其中多態性譜帶為153條，平均多態性譜帶15.3條，多態性比率為85.35 %。比較SRAP和ISSR擴增的總譜帶數和多態性譜帶比率，SRAP標記多態性高于ISSR標記。在20個供試杧果品種間，SRAP標記具有比ISSR標記更寬泛的變異范圍，說明前者比后者具有更高的標記效率，更精確的遺傳變異數據。SRAP和ISSR均可作為杧果品種遺傳多樣性的分析手段。相對來說，SRAP具有更高的多態性位點，能反映更多的遺傳信息。

3.2 SRAP和ISSR聚類結果比較分析

分子標記的應用評價是開展分子遺傳多樣性研究工作的基礎，不同的分子標記可能檢測到的遺傳信息水平不同[22]。在有些供試材料中甚至獲得相去甚遠的結果[23]。本研究中SRAP和ISSR分子標記對20份杧果種質資源進行遺傳聚類分析獲得了相似性較為一致的結果。如：在ISSR聚類分析中，云霞杧、粉紅杧、沅江象牙杧、桂熱杧82號、象牙22號、紫花杧、紅蘋杧聚類在C組；而在SRAP聚類分析中，云霞杧、粉紅杧、沅江象牙杧、桂熱杧82號聚類在C組，象牙22號、紫花杧、紅蘋杧卻聚類在D組。在SRAP和ISSR分析中，C組和D組聚類樹狀圖的格局有所不同，這主要是因為SRAP標記是在總結RAPD、AFLP標記優缺點的基礎上開發出的一種基于PCR的DNA分子標記技術。SRAP標記引物設計簡單，上游引物17 bp，下游引物18 bp，上下游引物之間可以隨機搭配，兩兩組合，降低了引物的設計難度，提高了引物的利用效率[24]。SRAP標記主要是針對開放閱讀框(ORF)進行擴增，主要擴增基因外顯子區域，并根據194個變異的信息進行聚類。ISSR標記針對基因中高度重復序列進行擴增，無需預知物種基因組信息，信息量豐富、重復性好、呈顯性標記、操作簡單，因而被廣泛應用于植物的遺傳多樣性研究中，并根據153個變異的信息進行聚類，從而導致了兩種方法聚類結果存在一定差異[25]。從聚類的信息量來看，SRAP標記聚類結果可靠性更高。

SRAP標記繼承了RAPD和AFLP標記的優點，克服了RAPD標記穩定差的缺點，同時克服了AFLP標記復雜的劣勢。ISSR標記吸收了RADP和SSR標記的優點，比RADP標記穩定性高、多態性豐富，比SSR標記簡單、無需特意性引物的設計[26-27]。本研究綜合利用SRAP和ISSR標記分析了20份杧果種質資源的遺傳多樣性，2種標記均能產生各自有效的多態性譜帶，并揭示出材料間的遺傳差異，能很好地將所有材料加以區分。筆者分別用194個(SRAP)和153 (ISSR)個多態性位點分析20份杧果種質資源，所得到的結果能夠真實、客觀地反應出供試材料間的遺傳關系。

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(責任編輯 王冠玉)

Analysis on Genetic Relationship of Some Mango(MangiferaindicaL.) Germplasms by SRAP Markers and ISSR Markers

ZHANG Yu,HUANG Guo-di,HUANG Qiang

(Guangxi Subtropical Crops Research Institute, Guangxi Nanning 530001, China)

The genetic variation and relationship of 20 mango germplasms were analyzed by SRAP and ISSR molecular markers in order to provide references for the identification of mango germplasm resources and breeding selection of parents. In SRAP analysis, from 80 pairs of primers, 12 pairs of primers were selected and 224 bands were amplified. Each primer combination amplified polymorphism belt in 13-21, with the average of 18.7. There were 194 polymorphic bands, with the average of 16.2. Polymorphism ratio was 86.61 %. The genetic similarity coefficient of materials was 0.54-0.94. In the ISSR analysis, from 100 primers, 10 primers amplified 179 bands.Each primer amplified bands from 11 to 20, with an average of 17.9,of which 153were polymorphic bands. The average polymorphism was 15.3 and polymorphic ratio was 85.35 %.The genetic similarity coefficient of materials was 0.58 - 0.90. The results showed that SRAP and ISSR markers were at the similarity coefficient of 0.624 and 0.665 levels. 20 copies of mango germplasm resources can be totally divided into 4 groups by SRAP and ISSR markers. Clustering results, due to high similarity, can be used for genetic diversity analysis and genetic relationship study of mango.

mango；genetic diversity；SRAP；ISSR

1001-4829(2016)09-2045-07

10.16213/j.cnki.scjas.2016.09.007

2016-04-01

廣西自然科學基金項目(2015GXNSFBA139085)；農業部熱作農技推廣與體系建設項目(16RZN-402)；國家行業(農業)科研專項經費項目(201203092-5)

張 宇(1983-)，男，河北博野人，助理研究員，主要從事果樹生理與分子生物學研究工作，E-mail：375900554@qq.com。

S667.7

A