異羥肟酸對宮頸癌細胞生長抑制作用的研究

魏萍+李苓+張瑋+張小玲+張婷婷+盛修貴

【中圖分類號】R490.5 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-6851（2016）12-0-01

組蛋白去乙酰化酶抑制劑（HDI）是一類特異性抑制組蛋白去乙酰化酶、促進染色質解螺旋、增強其趨近性，從而調節基因轉錄的小分子化合物。體內、外研究證明組蛋白去乙酰化酶抑制劑可通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導凋亡、抑制腫瘤血管生成及轉移、降低腫瘤侵襲力等機制發揮抗腫瘤作用，與放射聯合還有放射增敏作用[1]。

近來研究表明， 異羥肟酸有組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase ， HDAC）抑制劑活性， 可抑制多種腫瘤細胞生長。異羥肟酸被廣泛稱為低毒性HDAC抑制劑。Tambunan US[2]等研究提出了利用苯三唑對異羥肟酸修改，獲得一個更好的抑制劑。本研究觀察異羥肟酸對宮頸癌Hela 和Siha 細胞株生長和細胞周期的影響及p53mRNA 和蛋白表達改變。

1.材料與方法

1.1 材料

異羥肟酸購自Sigma 公司，用PBS 稀釋成500mmol/L， 過濾分裝，貯藏于- 20℃。P53抗體購自Santa Cruz 公司，為鼠抗人單抗。RPMI-1640 （Gibco 公司）。TRIZOL 試劑購自Invitrogen 公司。新生牛血清（杭州四季青）。FACSort 流式細胞儀為美國Becton Dickson 公司產品。四甲基偶氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）（Sigma）；AnnexinV-FITC 凋亡和細胞周期分析試劑盒為Becton Dickinson 公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞和細胞培養

Hela 和Siha 細胞株由本科室保存。細胞在5% CO2、37℃條件下，用含10% 新生牛血清、青霉素（100U/ml）、鏈霉素（100U/ml）的RPMI-1640 培養液培養傳代。

1.2.2 MTT 實驗檢測生長抑制率

取對數生長期宮頸癌細胞，按細胞濃度為5×104/ 孔接種于96 孔板。37℃、5%CO2 飽和濕度培養24h 后， 分別加入不同濃度SAHA（0， 1.2， 2.4， 5.0 mM） 的培養基，每孔200μl，對照組不做處理。分別于加藥后0、1、2、3和4天，每孔加入MTT 溶液（5mg/ml）20μl， 37℃避光培養4h。徹底吸去MTT 溶液，加入二甲基亞砜150μl/孔， 震蕩10min， 酶標儀490nm激發波長檢測吸光度。計算細胞的生長抑制率。細胞生長抑制率（%）=（1- 實驗組吸光度值/對照組吸光度值）×100%。每次實驗設3 復孔， 實驗重復3 次。

1.2.3 流式細胞儀（FCM）檢測細胞凋亡和細胞周期

Hela 細胞和Siha 細胞分別用含（0， 1.2， 2.4， 5.0 mM） SAHA的培養基培養48h 。胰酶消化成單細胞懸液， 1 000r/min 離心5min收集細胞， 加0.01mol/L PBS 洗滌離心2 次， 用4℃75% 乙醇固定過夜。1 000r/ min 離心5min ， 去掉乙醇固定液， PBS 洗滌2 次。加入PI 染液1ml（50μg/mlPI、20μg/ml RNase、0.1% Triton-100）， 4℃孵育30min ， FCM檢測凋亡細胞率。

1.2.4 RT- PCR 檢測p53表達

分別收集用含（0， 1.2， 2.4， 5.0 m M） SAHA處理48h的細胞。用TRIZOL 提取細胞總mRNA， 參照說明書進行。提取的mRNA 用紫外分光光度計檢測RNA的純度和濃度（A260 /A280>1.8）。取2μg mR-NA 為模板， 應用通用引物逆轉錄合成cDNA， 以cDNA 為模板進行PCR 擴增。P53 引物： 正義鏈5′-cctcttcggcccagtggac-3 ′， 反義鏈5′-ccgttttcgaccctgagag-3 ′，退火溫度60℃， 共28 個循環， 擴增產物369bp ；β-actin 引物： 正義鏈5′-ggcatcgtgatggactccg-3 ′，反義鏈5′-gctggaaggtggacagcga-3 ′， 退火溫度62℃， 共28個循環， 擴增產物594bp 。擴增條件為：94 ℃預變性3 min； 94 ℃ 40 s， 56 ℃ 40 s， 72 ℃ 1min， 30 個循環； 72 ℃延伸7 min。取PCR 產物5 μl在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳（ 100 V， 30 min） 。凝膠成像系統成像， 經薄層掃描求得每個待測產物與β-actin 產物光密度之比， 進行半定量分析。 PCR 產物在1.5% 的瓊脂糖凝膠上電泳， 電泳結果用英國UVP 公司GDS8000 型全自動圖像分析系統處理。

1.6 Western blot 分析p53蛋白表達水平 分別收集0， 1.2， 2.4， 5.0 m M SAHA 處理72 h 的細胞， 提取蛋白質， 采用Bradford 法定量蛋白質，取50μg蛋白進行SDS- PAGE 凝膠電泳。然后電轉膜到硝酸纖維素膜上。室溫下搖動封閉4h。TBS-T洗滌3 次， 加一抗（p53按1 ∶100 稀釋）在4 ℃下過夜。室溫下洗膜后加入辣根過氧化物酶偶聯兔抗小鼠IgG 抗體， 洗去未結合的二抗， 滴加化學發光劑ECL 進行發光顯影。TBS- T 洗滌3 次，再用二抗（1 ∶5 000 稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG）振蕩孵育2h 。采用化學發光法（ ECL）顯影。

1.3 統計學處理

計量資料用均數±標準差（±s） 表示，用SPSS11.5 軟件進行統計，數據比較采用t 檢驗，單變量多組資料之間比較采用單因素方差分析， 以P<0.05 為差異具有統計學意義。

2.結果

2.1 異羥肟酸抑制細胞生長

MTT 檢測結果顯示， 異羥肟酸顯著抑制Hela 和Siha 細胞生長，呈時間和濃度依賴性（ 見圖1A、1B ）。不同濃度（ 0～5 mmol /L）SAHA處理Hela 和Siha 細胞可抑制細胞生長， 差異有統計學意義（ F=4.87， P<0.01）；SAHA處理不同時間（ 0 h～96 h） 可抑制細胞生長， 差異有統計學意義（ F=3.78， P<0.01）。經直線回歸方程計算，異羥肟酸作用48、72、96 h 時IC50 值分別為14.08、6.78、4.25 mmol /L。

2.2 異羥肟酸對細胞周期的抑制

異羥肟酸可顯著影響宮頸癌Hela 和Siha 細胞的周期分布，使Hela 和Siha 細胞G0/G1 期比例顯著增加（P =0.001）（ 見表1 ） 。異羥肟酸降低Hela 細胞S 期（ P=0.052 ） 和G2/M 期（ P =0.059 ） 比例， 但差異無顯著性。異羥肟酸降低Siha 細胞S 期（ P =0.004 ） 和G2/M 期（ P=0.007 ） 比例， 差異有顯著性。

2.3 異羥肟酸上調p53表達

RT- PCR 檢測顯示異羥肟酸上調Hela 和Siha細胞的p53mRNA 表達 。Westernblot 檢測提示異羥肟酸促進Hela 和Siha 細胞的p53蛋白表達（ 見圖2） 。

3.討論

現有大量研究表明，癌癥的發生與表觀遺傳學有著密切的關系，主要包括組蛋白乙酰化、磷酸化、泛素化及DNA甲基化等，其在基因轉錄調節中起著重要的作用。Zhang Y[3]等在2004年發現組蛋白脫乙酰酶抑制劑能增強人鱗癌細胞放療的敏感性。為了進行基因表達，細胞必須在組蛋白周圍調控DNA的螺旋和非螺旋，而這一過程需在組蛋白乙酰化酶的協助下方能完成，故HDAC抑制劑可引起組蛋白超乙酰化，從而影響細胞的基因表達。HDACs 不僅僅能夠催化組蛋白的去乙酰化，而且能夠催化其他一些重要蛋白（ 如Hsp90、Tubulin 等） 和轉錄因子（ p53、STAT1 等） 的乙酰化. HDAC 在基因轉錄中起重要作用[4]；其可與某些轉錄因子（ 如E2F、Stat3、p53、NF-_B、TFIIE 及Rb 蛋白） 發生相互作用，從而調節基因轉錄[5]。

研究表明p53蛋白羧基端乙酰化能抑制乙酰化賴氨酸與泛素酶的結合并由此引起的降解[6]， 而這種單泛素化降解能促進p53蛋白的核轉運。因此p53羧基端乙酰化可穩定p53在核內停滯并影響其在線粒體中的功能表達。同時，在正常情況下，乙酰化p53在細胞中的比例很低。反映出在體內具有強去乙酰化作用[7-9]。早期研究顯示在多種腫瘤細胞中，p53羧基端乙酰化狀態能調節轉錄凋亡前效應[10-15]。

Xing J[16]等研究不同濃度SAHA 聯合順鉑（DDP）治療人類宮頸癌SiHa細胞，抑制和細胞凋亡率和細胞周期。SiHa細胞處理后20%的IC50SAHA24小時，經歷了各種劑量的輻射處理。S發現AHA在化療時通過上調p21和Bax促進SiHa信使rna和蛋白質的細胞凋亡，導致細胞周期阻滯于G0 / G1期。低劑量的SAHA在放療時通過Bax上調和Ku70下調促進SiHa細胞凋亡和抑制細胞修復。

本研究證實異羥肟酸抑制人宮頸癌Hela 和Siha細胞生長，可呈藥物依賴性地抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡。阻滯于G0-G1期的細胞明顯增多， P53水平顯著上升。異羥肟酸使Hela 和Siha細胞G0/G1 期細胞比例顯著增加， 推測異羥肟酸主要通過影響細胞周期， 使細胞阻滯于G0/G1 期， 從而抑制宮頸癌細胞生長。我們觀察到， 異羥肟酸對Hela 細胞的生長抑制強于對Siha 細胞的生長抑制。這可能因為Hela 細胞G0/G1 期比例明顯低于Siha細胞， Hela 細胞中有更多細胞處于S 期和G2/M 期， 推測異羥肟酸可能對增殖旺盛細胞的生長抑制作用更強。在宮頸癌細胞株中， HDAC抑制劑可經P53 途徑誘導腫瘤細胞凋亡[17]。HDAC抑制劑可增加P53的轉錄，上調P53基因的表達，阻止P53蛋白被E6降解[18]。本實驗中觀察到異羥肟酸上調p53表達， 引起G0/G1 期阻滯， 可見細胞凋亡。

新型HDAC 抑制劑在小劑量、低氧濃度情況下可誘導腫瘤細胞分化、選擇性凋亡。HDAC 抑制劑作為一種新型的靶向抗癌藥，正成為藥物研究的新熱點，臨床應用前景廣泛。這類抑制劑可以靶向性地使腫瘤細胞出現生長停滯、分化、凋亡，對正常細胞無毒性，而且其抗腫瘤譜廣，實用性較強，臨床潛力巨大。

參考文獻

[1]Ropero S， Esteller M. The role of histone deacetylases（HDACs） in human cancer[J]. Mol Oncol， 2007，1（1）：19-25.

[2]Tambunan US1， Bramantya N， Parikesit AA et，al..In silico modification of suberoylanilide hydroxamic acid （SAHA） as potential inhibitor for class II histone deacetylase （HDAC）[J]. BMC Bioinformatics 2011.

[3]Zhang Y，Jung M，Dritschilo A，et al.Enhancement of radiation sensitivity of human squamous carcinoma cells by histone deacetylase inhibitors[J].Radiat Res.2004 Jun；161（6）：667-74.

[4]Lin HY， Chen CS， Lin SP， et al. Tar-geting histone deacetylasein cancer therapy[J]. Med Res Rev， 2006， 26（4）： 397-413.

[5] ZhangY，JungM，DritschiloA， et al. Enhancementof radi2ation sensitivityof human squamous carcinoma cells byhistone deacetylase inhibitors[J]. Radiat Res， 2004， 161：6672674

[6] Grossman SR， Deato ME， Brignone C，et al. Polyubiquitination of p53 by a ubiquitin ligase activity of p300[J]. Science， 2003，300（5617）： 342-344.

[7] Luo J， Li M，Tang Y， et al. Acetylation of p53 augments its site-specific DNA binding both in vitro and in vivo[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2004，101（8）： 2259-2264.

[8] Li M， Luo J， Brooks CL， et al. Acetylation of p53 inhibits its ubiquitination by Mdm2[J]. J Biol Chem， 2002， 277（52）： 50607-50611.

[9]Zhao Y， Lu S，Wu L， et al. Acetylation of p53 at lysine 373/382 by the histone deacetylase inhibitor depsipeptide induces expression of p21（Waf1/Cip1）[J]. Mol Cell Biol， 2006， 26（7）： 2782-2790.

[10] Zhang S， Cao HJ， Davis FB， et al. Oestrogen inhibits resveratrol-induced post-translational modification of p53 and apoptosis in breast cancer cells[J]. Br J Cancer， 2004， 91（1）： 178-185.

[11]Luo J， Nikolaev AY， Imai S， et al. Negative control of p53 by Sir2alpha promotes cell survival under stress[J]. Cell， 2001， 107（2）：137-148.

[12] Fu M， Wang C， Zang X， et al. Acetylation of nuclear receptors in cellular growth and apoptosis[J]. Biochem Pharmacol， 2004.68（6）： 1199-1208.

[13] Vaghefi H， Neet KE. Deacetylation of p53 after nerve growth factor treatment in PC12 cells as a post-translational modification mechanism of neurotrophin-induced tumor suppressor activation[J]. Oncogene，2004，23（49）： 8078-8087.

[14] Imanishi R， Ohtsuru A， Iwamstsu M， et al. A histone deacetylase inhibitor enhances killing of undifferentiated thyroid carcinoma cells by p53 gene therapy[J]. J Clin Endocrinol Metab， 2002， 87（10）： 4821-4824.

[15] Luo J， Su F， Chen D， et al. Deacetylation of p53 modulates its effect on cell growth and apoptosis[J]. Nature， 2000，408（6810）： 377-381.

[16]Xing J， Wang H， Xu S， et al.Sensitization of suberoylanilide hydroxamic acid （SAHA） on chemoradiation for human cervical cancer cells and its mechanism[J].Eur J Gynaecol Oncol[ J ]. 2015，36（2）：117-22.

[17] Ropero S， Esteller M. The role of histone deacetylases （HDACs） in human cancer[J]. Mol Oncol， 2007， 1（1）： 19-25.

[18] Cruz-Hernandez E， et al. The effects of DNA methylation and histone deacetylase inhibitors on human papillomavirus early gene expression in cervical cancer， an in vitro and clinical study[J]. Virol J. 2007，16（2）：216-22..