紫蘇RAS基因啟動子的克隆及序列分析

摘要：迷迭香酸合成酶（Rosmarinic acid synthase，RAS）是紫蘇（Perilla frutescens）迷迭香酸生物合成途徑中的關鍵酶，采用基因組步移方法，克隆得到長度為2 022 bp的紫蘇RAS基因5′端的啟動子片段，并對啟動子序列的轉錄起始位點和順式作用元件進行分析。結果表明，紫蘇RAS基因啟動子調控區域除了含有基本的TATA-box和CAAT-box元件外，還含有多個與植物脅迫和生長相關的順式作用元件，如脫落酸、茉莉酸甲酯和赤霉素響應的順式作用元件等，另外還包含多個光響應順式作用元件。

關鍵詞：紫蘇（Perilla frutescens）；迷迭香酸合成酶；啟動子；克隆；序列分析

中圖分類號：Q785 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）10-2656-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.10.052

Abstract： The rosmarinic acid synthase（RAS） is considered to be a key enzyme involved in rosmarinic acid biosynthesis pathway of Perilla frutescens. A 2 022 bp RAS gene promoter fragment was cloned using genomic walking technique. The analysis of transcription start point and cis-acting elements of the promoter showed that the fragment contained the conserved promoter sequence， such as TATA-box，CAAT-box. Furthermore，it contained many plant stress and growth-related cis-acting elements，such as cis-acting element involved in the ABA，MeJA and GA responsiveness，and it has many light responsive elements as well.

Key words： Perilla frutescens； rosmarinic acid synthase； promoter； cloning； sequence analysis

基因的表達和調控是植物基因工程研究的重要內容，啟動子作為轉錄水平調控中最主要的調控元件，對其功能及調控相關的研究已成為一個熱點。啟動子提供RNA聚合酶及其轉錄因子識別和結合的DNA序列，能結合RNA聚合酶及其轉錄因子的區域稱為順式作用元件。植物基因啟動子中包含多種重要的順式作用元件參與調控下游相應基因的表達，并決定轉錄的方向和效率以及所用的RNA聚合酶類型[1]，因此，對植物啟動子的研究有助于了解基因轉錄調控的表達模式及其調控機制。植物啟動子由核心區域和上游調控區構成，核心啟動子區域的結構通常包含TATA-box和轉錄起始位點。TATA-box位于轉錄起始位點上游幾十個堿基處，毗鄰核心啟動子的上游區域即是啟動子上游調控序列，富含轉錄因子結合位點。部分與逆境有關的啟動子序列中還包含相應的與逆境誘導相關的順式作用元件，如脫落酸響應元件（Abscisic acid responsive element）[2]、茉莉酸響應元件（Jasmonate responsive element）[3]、乙烯響應元件（Ethylene responsive element）[4]和低溫響應元件（Low temperature responsive element）[5]等。植物基因工程的啟動子根據其作用方式及功能可分為3類：組成型啟動子、特異型啟動子和誘導型啟動子[6]。

紫蘇（Perilla frutescens）為唇形科紫蘇屬一年生草本植物，別名紅蘇、香蘇、蘇子、赤蘇，是國家衛生部第一批頒布的藥食兼用的60種中藥之一[7]，紫蘇的莖葉和紫蘇油中含有酚類、萜類、黃酮類以及花青素和多糖等多種具有生物活性功能的成分，其生物活性主要表現為抗氧化、降血脂、抑癌、抗炎、止血、提高記憶力和視覺能力等[8]。

迷迭香酸合成酶（RAS）是迷迭香酸生物合成途徑中將苯丙氨酸支路和酪氨酸支路連接合成迷迭香酸前體物質的關鍵酶[9]。目前，已經在多種植物中克隆得到RAS基因序列，如彩葉草[10]、香蜂草[11]和薰衣草[12]等，但迄今對迷迭香酸合成酶基因上游啟動子的研究尚未見報道。因此，對RAS基因啟動子序列的克隆及分析將有助于探究RAS基因在紫蘇迷迭香酸生物合成途徑中的作用。在前期從紫蘇中克隆所得RAS基因的基礎上[13]，首先克隆RAS基因全長DNA序列，以此為依據設計特異性引物，采用基因組步移（Genome walking）技術克隆得到紫蘇RAS基因的啟動子序列，對其序列進行生物信息學分析，本研究為后續的啟動子功能分析及應用奠定了基礎，并為通過調控啟動子來提高RAS基因的表達水平，促進紫蘇迷迭香酸的生物合成提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試種子 供試紫蘇種子由黑龍江省饒河縣饒河農場提供，種植于光照培養箱中，培養條件為溫度25 ℃、光照時間16 h/d，葉片采集后于液氮中速凍并放入-80 ℃冰箱保存備用。

1.1.2 試劑 pMD 18-T Vector試劑盒、大腸桿菌（Escherichia coli） DH5α菌株、DNA Marker、Plant DNA Isolation Reagent和LA Taq酶均購自寶生物工程（大連）有限公司；PCR產物純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購于Axygen公司；Genome Walker Universal Kit購自Clontech公司；其他常規化學試劑為國產分析純，引物合成與測序工作由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 紫蘇基因組DNA的提取及檢測 以紫蘇幼苗葉片為試驗材料，使用Plant DNA Isolation Reagent提取基因組DNA，具體試驗方法參照試劑盒說明書，并將提取的總DNA在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

1.2.2 紫蘇RAS基因全長DNA序列的克隆及分析以已克隆出的紫蘇RAS基因的cDNA序列（GenBank登錄號：KC355369）為參考，設計用于克隆RAS全長DNA的引物RAS-F（5′-ATGAAGATAGAAGTCAAAGAC-3′）和RAS-R（5′-TCAAATCTCATAAAACAAC-3′），以基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1.5 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。將PCR產物電泳檢測并采用Axygen DNA凝膠回收試劑盒進行目的條帶的回收與純化，連接到pMD18-T載體上，轉化大腸桿菌DH5α感受態，經抗性篩選并挑選陽性克隆后由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.2.3 紫蘇RAS基因啟動子的克隆 參考Genome Walker Universal Kit說明書，用4個限制性內切酶（DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ、StuⅠ）分別酶切基因組DNA，并對酶切產物進行純化處理。將純化后的產物與Genome Walker Adaptor連接，構建基因組步移文庫，以此作為啟動子克隆的模板。

根據紫蘇RAS基因DNA序列分析結果，設計用于基因組步移的下游特異性引物，RAS-GSP1（5′-CGACCAGGGCGCGGCTGAGCGCCGC-3′）和RAS-GSP2（5′-AAGTTGGCCGCGCCGTCGTGGCGGTA-3′），并將試劑盒提供的AP1和AP2作為上游引物，采用巢式PCR擴增RAS基因啟動子序列，PCR反應體系及條件參考試劑盒說明書。用膠回收試劑盒回收PCR產物，然后進行TA克隆并提取重組質粒送至測序公司測序。

1.2.4 紫蘇RAS基因啟動子的生物信息學分析 啟動子序列的轉錄起始位點采用Neural Network Promoter Prediction（http：//www. fruitfly.org/seq_tools/

promoter.html）預測，并采用PlantCARE數據庫（http：//bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析預測啟動子序列中的順式作用元件。

2 結果與分析

2.1 紫蘇RAS基因全長DNA序列分析

參考紫蘇RAS基因的cDNA序列，通過PCR反應獲得RAS基因的全長DNA序列（圖1），以測序得到的序列信息，設計用于基因組步移的特異性引物。序列分析發現紫蘇RAS基因是一個無內含子基因（Intron-free gene），與已報道的從香蜂草（Melissa officinalis）中克隆得到的RAS基因結構相似[11]。

2.2 紫蘇RAS基因啟動子的克隆

基因組DNA（圖2a）經DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ、StuⅠ 4個限制性內切酶消化后（圖2b），經過純化、連接Adaptor后作為模板，與引物RAS-GSP1和AP1進行Outer PCR擴增反應，結果如圖2c所示。在7號泳道（EcoRⅤ酶切構建文庫）出現了一條暗的條帶，以其作為模板，并以RAS-GSP2和AP2為引物進行Inner PCR反應，得到了大小為2 000 bp的片段，如圖2d所示。將PCR產物切膠回收并進行TA克隆后，送至寶生物工程（大連）有限公司測序，得到長度為2 022 bp的5′側翼區序列。

2.3 紫蘇RAS基因啟動子的序列分析

利用Neural Network Promoter Prediction對RAS基因啟動子進行轉錄起始位點預測，發現在 1 918～1 968 bp處序列為：5′-AAAATTATAGTATA AGAGGGGCAAAATGGGTAATTCAGGTGGAATAAA TA-3′存在轉錄起始位點，預測的轉錄起始位點堿基為位于1 958 bp處的G，其可能性為97%。啟動子序列除含有多個啟動子必需的CAAT-Box和TATA-Box外，還有與激素、光照和環境因素等相關的調控元件（圖3）。各元件在序列中的詳細信息見表1。

3 小結與討論

植物的生長發育受基因的調控，基因調控可分為基因結構活化、轉錄水平調控、轉錄后水平調控、翻譯及翻譯后水平調控等，從調控效果來看，最為有效的調控方式是轉錄水平調控。研究發現，轉錄水平調控主要涉及啟動子、轉錄因子和RNA聚合酶3種因素的相互作用，其中最為主要的調控元件是啟動子，對基因啟動子的分離與功能的解析能更好地了解基因表達的調控機制，并可以進一步采用基因工程手段實現目的基因的高效表達[14]。

目前，植物啟動子的研究和應用已取得了重大進步，并已成功分離多種植物中的啟動子序列[15-17]。RAS是紫蘇迷迭香酸生物合成途徑中的關鍵酶，迄今未見其啟動子的研究報道。本研究利用基因組步移技術，從紫蘇基因組DNA中獲得了RAS基因的5′端2 022 bp的側翼序列，推測的轉錄起始位點G（定義為+1）位于起始密碼子上游67 bp處。通過PlantCARE在線分析，發現距離轉錄起始位點最近的TATA-box，位置與其在真核生物基因中的通常分布情況相一致。該啟動子序列含有真核生物典型的核心啟動子區域，并含有眾多應答激素和脅迫信號的順式作用元件，如脫落酸響應順式元件（ABRE），赤霉素響應元件（GARE-motif），干旱誘導相關MYB結合位點（MBS）和植物生長素響應元件（TGA-element）等。在植物的生長發育過程中，光作為一種重要的信號調控相關基因的表達，常見的受光調節啟動子中的順式作用元件有3-AF1 binding site、AE-Box、GA-motif、GAG-motif、G-Box、I-box、Sp1和TCT-motif等，其中I-box更是單子葉和雙子葉植物中很多光調控基因啟動子所具有的、帶有重要功能的調控元件[18]。本研究發現在RAS基因啟動子序列中含有3-AF1 binding site、G-Box、I-box和Sp1光應答原件，能夠調節其受光誘導后的轉錄活性。另外，在啟動子中存在茉莉酸甲酯（MeJA）響應的順式作用元件（CGTCA-motif），表明RAS基因的表達受到茉莉酸甲酯的誘導，這與之前報道的MeJA在一定程度上可以上調RAS基因的轉錄水平相一致[13]。

綜上所述，紫蘇RAS基因啟動子序列中具有的多種響應元件說明其表達可能受到干旱、光脅迫以及茉莉酸甲酯、脫落酸、赤霉素等環境因素的影響，但是由于生物基因表達調控的復雜性，所預測的啟動子順式作用元件是否與預測的功能完全一致還有待進一步驗證和分析。為此，后續將采用啟動子缺失等方法對其功能和結構域開展研究，并進一步通過構建嵌合啟動子為紫蘇的定向育種提供參考依據。

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