耐力運動通過抑制HIF-1α/iNOS預防高脂飲食小鼠脂肪組織炎癥

鄒華剛，陳香仙

耐力運動通過抑制HIF-1α/iNOS預防高脂飲食小鼠脂肪組織炎癥

鄒華剛，陳香仙

目的：研究耐力運動對高脂飲食小鼠脂肪組織HIF-1α/iNOS信號的影響，探討運動預防脂肪組織炎癥的分子機制。方法：8周齡C57BL/6小鼠40只隨機分為正常飲食對照組(NC)、正常飲食運動組(NE)、高脂飲食對照組(HC)、高脂飲食運動組(HE)，運動組進行8周跑臺運動(13 m/min)。ELISA法測定血清TNF-α、IL-6，RT-PCR法測定基因表達，Western Blot法測定蛋白表達。結果：與NC組相比，HC組小鼠血清TNF-α、IL-6濃度顯著升高(P<0.05)，脂肪組織SVCs TNF-α、IL-6、IL-1β、HIF-1α、PDK1、LDH-A、GLUT1、iNOS mRNA表達均顯著升高(P<0.05)，HIF-1α和iNOS蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與NC組相比，NE組小鼠SVCs HIF-1α mRNA和蛋白表達顯著下降(P<0.05)，其余參數無顯著差異；與HC組相比，HE組血清TNF-α、IL-6顯著下降 (P<0.05)，脂肪組織SVCs TNF-α、IL-6、IL-1β、HIF-1α、PDK1、LDH-A、GLUT1、iNOS mRNA表達顯著下降，HIF-1α、iNOS蛋白表達顯著下降(P<0.05)。結論：8周耐力跑臺運動可有效預防高脂飲食小鼠脂肪組織慢性炎癥，其機制可能與運動抑制脂肪組織巨噬細胞HIF-1α/iNOS信號軸有關。

耐力運動；脂肪組織；低氧；慢性炎癥；胰島素抵抗；鼠；動物實驗

Hotamisligil等人1993年發現，肥胖動物脂肪中炎癥因子腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α,TNF-α)表達增多為引發胰島素抵抗的關鍵因素[5]。Weisberg等人2003年指出，肥胖動物脂肪中巨噬細胞為慢性炎癥反應的主要效應細胞，脂肪大部分炎癥因子如TNF-α、 白細胞介素6(interleukin,IL-6)、IL-1β等源自巨噬細胞[18]。脂肪組織巨噬細胞(adipose tissue macrophage,ATMs)與慢性炎癥、肥胖性胰島素抵抗之間的關系經過10年左右的研究取得豐富成果，加深了人們對ATMs功能的理解和認識，健康脂肪中ATMs以抗炎的M2表型存在，肥胖時ATMs激活轉化為促炎的M1表型，脂肪組織微環境的變化為ATMs表型轉化重要機制[12]。缺氧可能為ATMs表型轉化的一個重要原因[3]。肥胖時脂肪細胞體積增加使脂肪組織膨脹，局部血流供應不足，引起細胞氧氣供應不足[15]。缺氧激活轉錄因子低氧誘導因子(hypoxia-inducible factor,HIF-1α)，HIF-1α調控誘導型一氧化氮合成酶(inducible nitric synthase,iNOS)表達，iNOS通過催化底物L-精氨酸，釋放一氧化氮(nitric oxide,NO)[9]，過量NO促進脂肪組織炎癥和胰島素抵抗[12]。

有動物、人體實驗證明，運動是預防和改善慢性炎癥的有效途徑之一[20]。Kawanishi等發現，16周耐力訓練(12～20 m/min，60 min/天)不但顯著降低高脂飲食小鼠脂肪組織巨噬細胞標志物，更誘導M1-M2表型轉化，有效改善脂肪組織慢性炎癥[7]。一次急性運動雖不足以降低大鼠脂肪組織巨噬細胞數量，卻可誘導M1-M2表型轉化，改善慢性炎癥和胰島素敏感性[11]。然而，運動抗炎的相關分子機制鮮有報道，鑒于缺氧對脂肪組織炎癥的重要作用，緩解脂肪組織缺氧可能為運動改善炎癥的途徑之一。Disanzo等發現，8周跑臺耐力訓練顯著降低肥胖大鼠附睪脂肪乳酸水平，提示脂肪組織缺氧得到改善[1]。運動對肥胖動物脂肪組織中巨噬細胞缺氧情況的影響鮮有報道，本研究觀察8周中等強度耐力跑臺運動對高脂飲食(high fat diet,HFD)小鼠脂肪組織巨噬細胞HIF-1α/iNOS信號的影響。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗對象與分組

8周齡C57BL/6小鼠40只購自上海斯萊克動物有限公司，適應飼養1周后隨機分為正常飲食對照組(NC)、正常飲食運動組(NE)、高脂飲食對照組(HC)、高脂飲食運動組(HE)，每組10只。清潔級動物房飼養溫度22～25℃，相對濕度50%～65%，每天光照12 h。

1.2 運動干預和取材

1.3 實驗試劑和儀器設備

實驗試劑：蛋白裂解液，蛋白酶抑制劑，BCA蛋白濃度測定試劑盒、預染蛋白分子量標準，ECL發光液(江蘇碧云天生物)；TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒(南京建成)，Trizol(Invitrogen)，一抗HIF-1α(美國Santa Cruz)，iNOS(美國Santa Cruz)，內參GAPDH(美國Santa Cruz)，羊抗兔二抗(江蘇碧云天生物)。

儀器設備：低溫離心機(北京時代北利)，超低溫冰箱(Thermol Scientic)，電動勻漿器(北京優尼康)，酶標儀(瑞士Tecan)，PCR儀(美國應用生物)，熒光定量PCR儀(美國應用生物)，電泳儀(北京六一)。

1.4 指標測試與方法

1.4.1 RT-PCR法檢測脂肪組織基因表達

Trizol法提取脂肪組織總RNA：100 mg附睪脂肪于1 mL Trizol剪碎，勻漿2～3次，14 000 rpm、4℃離心10 min，取上清，加入200 μl氯仿，室溫靜置5 min，14 000 rpm、4℃離心15 min，取上層水相(約400 μl)加等體積(約400 μl)異丙醇，室溫靜置10 min，14 000 rpm、4℃離心10 min，去上清，1 mL預冷75%乙醇重懸沉淀，7 500 rpm、4℃離心5 min，去乙醇，20 μl DEPC水溶解RNA，酶標儀檢測RNA濃度和純度。

RNA逆轉錄反應。根據逆轉錄試劑(TOYOBO)盒說明書進行RNA逆轉錄反應：20 μl反應體系包括5×buffer 4 μl，RT酶Mix 1 μl，Primer Mix1 1 μl，RNA模板2 μl，DEPC水12 μl，cDNA產物可保存于-20℃。SYBR Green摻入法進行PCR擴增反應：20 μl反應體系包括SYBR Green Mix 10 μl，cDNA 2 μl，上、下游引物各0.04 μl(共0.2 μM)，DEPC水7.92 μl。反應條件為95℃ 1 min預變性→95℃ 15 s變性→60℃ 30 s退火→72℃ 45 s延伸，進行50個循環，統計Ct值(表1)。

1.4.2 分離脂肪組織SVCs

附睪脂肪基質血管組分細胞(stromal vascular fraction cells,SVCs)分離：200 mg附睪脂肪于2 ml PBS (0.5%BSA)中剪碎，轉移到50 ml離心管， 1 mL PBS(0.5%BSA)涮洗殘留組織轉移到50 ml離心管，加入3 mL II型膠原酶消化液 (PBS +0.5%BSA+4 mg/mL II型膠原酶)，37℃水浴孵育消化20 min，加入10 ml PBS (0.5%BSA)，移液槍反復吹打細胞團，100 μm細胞濾網過濾細胞懸液，轉移至新50 ml離心管，500 g、4℃離心10 min，棄上清，收集底層SVCs細胞團[13]。5 ml PBS(0.5%BSA)重懸和沖洗SVCs細胞，500 g、4℃離心5 min，western blot備用。

1.4.3 Western blot法檢測蛋白表達

細胞蛋白裂解液裂解細胞，BCA法測定蛋白濃度(BSA為標準品)。10%濃度的SDS-PAGE 分離HIF-1α和iNOS，每孔蛋白上樣量20 μg，濕法轉膜1 h，5%脫脂牛奶封閉1 h，1×TBST洗膜，3×5 min，一抗(HIF-1α 1∶1 000；iNOS 1∶500 ；GAPDH 1∶1 000)4℃孵育過夜，1×TBST洗膜，3×5 min，二抗(羊抗兔IgG 1∶3 000～5 000)室溫孵育2 h，1×TBST 洗膜3×5 min，加入ECL發光液，暗室曝光，Image J軟件讀取條帶灰度值，以目的蛋白與內參蛋白灰度值比值為蛋白相對表達含量。

表 1 靶基因引物序列一覽表Table 1 Primer Sequence of Target Gene

1.5 數據統計分析

所有實驗數據均以平均數±標準差形式呈現，采用SPSS 11.0軟件進行雙因素方差分析，以P<0.05為顯著性差異。

2 實驗結果

2.1 8周跑臺運動對高脂飲食小鼠生理和代謝指標影響

表2所示，與NC組相比，HC組小鼠體質量、附睪脂肪含量、血清TNF-α、IL-6顯著增加或升高(P<0.05)；與NC組相比，NE組小鼠各參數無顯著變化；與HC組相比，HE組小鼠體質量、附睪脂肪含量、血清TNF-α、IL-6顯著下降(P<0.05)。

表 2 運動對小鼠生理和代謝指標的影響一覽表Table 2 The Effect of Exercise on Physiology and Metabolic Parameters of Mice

注：* 表示與NC組相比P<0.05 ；#表示與HC組相比P<0.05，下同。

2.2 8周跑臺運動對高脂飲食小鼠附睪脂肪SVCs炎癥因子基因表達的影響

圖1所示，與NC組相比，HC組小鼠附睪脂肪SVCs TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達顯著升高(P<0.05)；與NC組相比，NE組小鼠附睪脂肪SVCs TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達具下降趨勢但無顯著差異；與HC組小鼠相比，HE組小鼠附睪脂肪SVCs TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達均顯著下降(P<0.05)。

2.3 8周跑臺運動對高脂飲食小鼠附睪脂肪SVCs 缺氧相關基因表達的影響

圖2所示，與NC組相比，HC組小鼠附睪脂肪SVCs HIF-1α、丙酮酸脫氫酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase 1,PDK1)、葡萄糖轉運體1(glucose transporter 1,GLUT1)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogense A,LDH-A) 、iNOS mRNA表達顯著升高(P<0.05)；與NC組相比，NE組小鼠附睪脂肪SVCs缺氧相關基因表達無顯著差異；與HC組小鼠相比，HE組小鼠附睪脂肪SVCs HIF-1α、PDK1、GLUT1、LDH-A 、iNOS mRNA表達顯著下降(P<0.05)。

圖 1 運動對小鼠附睪脂肪SVCs 炎癥基因表達變化的影響柱狀圖Figure 1. The Effect of Exercise on Inflammatory Gene Expression in Epididymis Fat Pad SVCs

圖 2 運動對小鼠附睪脂肪SVCs缺氧相關基因表達的影響柱狀圖Figure 2. The Effect of Exercise on Hypoxia-induced Gene Expression in Epididymis Fat Pad SVCs

2.4 8周跑臺運動對高脂飲食小鼠附睪脂肪SVCs HIF-1α表達的影響

圖3所示，與NC組相比，HC組小鼠附睪脂肪SVCs HIF-1α蛋白表達顯著升高 (P<0.05)；與NC組相比，NE組小鼠附睪脂肪SVCs HIF-1α蛋白表達顯著下降；與HC組小鼠相比，HE組小鼠附睪脂肪SVCs HIF-1α蛋白表達顯著下降 (P<0.05)。

圖 3 運動對小鼠附睪脂肪 SVCs HIF-1α蛋白表達的影響示意圖Figure 3. The Effect of Exercise on HIF-1α Protein Expression in Epididymis Fat Pad SVCs

2.5 8周跑臺運動對高脂飲食小鼠附睪脂肪SVCs iNOS蛋白表達的影響

圖4 所示，與NC組相比，HC組小鼠附睪脂肪SVCs iNOS蛋白表達顯著升高 (P<0.05)；與NC組相比，NE組小鼠附睪脂肪SVCs iNOS蛋白表達無顯著變化；與HC組小鼠相比，HE組小鼠附睪脂肪SVCs iNOS蛋白表達顯著下降 (P<0.05)。

3 分析與討論

肥胖小鼠脂肪組織巨噬細胞增多，炎癥水平提高，糖尿病治療藥物羅格列酮顯著降低肥胖小鼠脂肪組織巨噬細

圖 4 運動對小鼠附睪脂肪 SVCs iNOS蛋白表達的影響圖Figure 4. The Effect of Exercise on iNOS Protein Expression in Epididymis Fat Pad SVCs

胞和炎癥標志物，提示，脂肪組織巨噬細胞介導的慢性炎癥實為肥胖誘導胰島素抵抗發生的關鍵機制，同時慢性炎癥靶向藥物可能是糖尿病治療的重要方向[19]。本研究發現，8周高脂飲食小鼠體質量、附睪脂肪含量顯著提高，外周血中炎癥因子TNF-α、IL-6濃度顯著升高，附睪脂肪組織炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達顯著提高，提示，8周高脂飲食小鼠脂肪組織局部和整個機體炎癥水平明顯升高。脂肪組織炎癥分子機制為當下糖尿病醫學研究的熱點話題，肥胖時脂肪組織缺氧的觀點逐漸被人接受。細胞對缺氧的主要應答調控因子為HIF-1α，氧氣充足時，加雙氧酶利用氧氣和α-酮戊二酸羥基化修飾HIF-1α蛋白的關鍵脯氨酸和天冬氨酸位點，脯氨酸-402位點和/或-564位點的羥基化對希佩爾林道蛋白(VHL)的蛋白結合活性不可或缺，VHL幫助E3泛素連接酶識別，經蛋白酶體途徑降解HIF-1α，此外，HIF-1α天冬氨酸-803位點的羥基化阻斷轉錄輔助激活因子p300和CBP結合HIF-1α的轉錄激活結構域，進一步抑制HIF-1α轉錄功能。然而，缺氧情況下，羥化酶活性被抑制，HIF-1α激活[6]，細胞代謝由葡萄糖氧化磷酸化供能轉向糖酵解供能，葡萄糖轉化成丙酮酸，丙酮酸經乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)直接轉化為乳酸。HIF-1α對細胞代謝轉化過程至關重要，糖酵解代謝中LDH-A、磷酸果糖激酶L(phosphofructokinase L,PFKL)[16]、丙酮酸脫氫酶激酶1(pyruvate dehydrogenase kinase 1,PDK1)[8]等多個基因由HIF-1α編碼。HIF-1通過轉錄激活PDK1抑制三羧酸循環代謝，PDK1是糖酵解代謝關鍵限速酶，可磷酸化抑制丙酮酸脫氫酶，細胞氧氣充足時，丙酮酸脫氫酶催化丙酮酸轉化為乙酰輔酶A進入三羧酸循環，產生還原NADH攜帶電子經線粒體內膜復合物I (NADH脫氫酶)進入呼吸鏈，復合物I、III和IV 3個質子泵不斷將質子輸送到線粒體膜間隙，產生跨膜的電化學梯度(質子動力)，質子通過復合物V(ATP合成酶)回流進入線粒體基質，質子動力驅動ATP合成酶合成ATP。HIF-1α還轉錄調控葡萄糖轉運子1(glucose transporter 1,GLUT1)，Freemerman等發現，GLUT1過表達可通過誘導巨噬細胞糖代謝轉向糖酵解激活巨噬細胞，提高炎癥因子分泌[2]。

高脂飲食肥胖小鼠和ob/ob肥胖小鼠炎癥水平升高的同時，脂肪組織缺氧標志物HIF-1α和GLUT1 mRNA和蛋白表達顯著升高，脂肪組織氧分壓下降。免疫組化和特異性低氧探針發現，肥胖小鼠脂肪組織間質區域缺氧尤為顯著，缺氧區域與F4/80+巨噬細胞重疊，提示脂肪組織巨噬細胞對缺氧尤為敏感[14]。缺氧處理原代培養的正常小鼠腹膜巨噬細胞8 h，HIF-1α、GLUT1、VEGF、PDK1 mRNA表達顯著升高，而TNF-α、IL-1、IL-6 mRNA低氧處理2 h表達就顯著增加，缺氧提高了轉錄因子NF-κB結合活性和TNF-α啟動子轉錄活性[21]。本研究發現，8周高脂飲食小鼠附睪脂肪組織SVCs炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達顯著升高，缺氧標志性基因HIF-1α、GLUT1、PDK1和LDHA mRNA表達顯著提高，同時，HIF-1α蛋白表達顯著增加。脂肪組織基質血管組分(stromal vascular fraction,SVF)富含巨噬細胞、T細胞、脂肪前體細胞、間充質干細胞，其中巨噬細胞數量最多[10]，因此，研究時常采用SVCs作為脂肪組織巨噬細胞研究對象。本研究顯示，8周高脂飲食小鼠SVCs HIF-α靶基因iNOS mRNA和蛋白表達均顯著增加。

有證據表明，耐力運動、抗阻練習能降低肥胖人群的炎癥水平[7]。本研究發現，8周耐力跑臺訓練顯著抑制高脂飲食小鼠附睪脂肪組織SVCs炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達，血清炎癥因子TNF-α、IL-6濃度顯著低于HC組，提示8周耐力跑臺訓練可有效抑制高脂飲食誘導的慢性炎癥。運動預防和治療慢性炎癥部分可能與脂肪組織缺氧得到改善有關。研究還顯示，8周耐力跑臺運動顯著抑制附睪脂肪組織SVCs 缺氧標志物HIF-1α、GLUT1、PDK1和LDHA mRNA表達， HIF-1α蛋白表達顯著降低，HIF-1α另一個靶基因iNOS mRNA和蛋白表達均顯著下降。然而，8周耐力跑臺訓練對正常小鼠炎癥基因和缺氧相關基因表達并無影響，卻顯著降低HIF-1α mRNA和蛋白表達，相關機制尚不清楚，本研究未對此進一步深入研究。但是，有文獻從運動促進脂肪組織血管生成角度闡述運動改善脂肪組織缺氧的機制。Hatano等發現，9周耐力訓練顯著提高Wistar大鼠脂肪組織SVCs 血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGF-A)及其受體表達，脂肪內皮細胞密度增加[4]。Disanzo等發現，8周耐力跑臺訓練提高Zuker肥胖大鼠脂肪組織VEGF-A表達，同時降低乳酸水平[1]。

4 結論

8周耐力跑臺運動有效預防高脂飲食小鼠慢性炎癥，其機制可能與運動抑制脂肪組織巨噬細胞HIF-1α/iNOS信號軸有關。

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Endurance Exercise Preventing Adipose TissueInflammation by Inhibiting HIF-1α/iNOS

ZOU Hua-gang,CHEN Xiang-xian

Objective:The effects of endurance exercise on HIF-1α/iNOS signaling in adipose tissue of high fat diet feeding mice were investigated to explore the molecular mechanisms of exercise-induced prevention from adipose tissue inflammation induced by high fat diet.Methods:40 8-week old C57BL/6 mice were randomly divided into 4 groups,namely normal diet control (NC),normal diet exercise (NE),high fat diet control (HC) and high fat diet exercise (HE) with each group 10 mice.Exercise group were subjected to 8 week treadmill running program at a speed of 13 m/min.ELISA assay was used to measure serum TNF-α and IL-6.RT-PCR was used to determine gene expression while Western Blot was used to determine protein expression.Results:Compared to NC group,serum TNF-α,IL-6 and TNF-α,IL-6,IL-1β,HIF-α,PDK1,GLUT1,LDHA,iNOS mRNA expression as well as HIF-1α and iNOS protein expression in adipose tissue SVCs of HC group were significantly elevated (P<0.05).Campared with NC group,HIF-1α mRNA and protein expression in adipose tissue SVCs of NE group were reduced markedly(P<0.05) while other indicators changed without significance.Compared with HC group,serum TNF-α,IL-6 and TNF-α,IL-6,IL-1β,HIF-α,PDK1,GLUT1,LDH-A,iNOS mRNA expression as well as HIF-1α and iNOS protein expression in adipose tissue SVCs of HE group were significantly reduced(P<0.05).Conclusion:8 week endurance treadmill running efficiently prevent chronic inflammation of high fat diet feeding mice possibly by inhibiting HIF-1α/iNOS signaling pathway.

enduranceexercise;adiposetissue;hypoxia;HIF-1α;chronicinflammation;insulinresistance；rat;animalexperiment

1002-9826(2016)02-0085-05

10.16470/j.csst.201602013

2015-02-27；

2015-12-30

鄒華剛(1976-)，男，安徽安慶人，講師，碩士，主要研究方向為運動康復與社會體育，Tel:(0553)5910709,E-mail:365522253@qq.com；陳香仙(1964-)，女，浙江金華人，教授，博士，主要研究方向為運動損傷與康復，Tel:(0553)5910709,E-mail:jhchxxlu@mail.ahnu.edu.cn。

安徽師范大學 體育學院，安徽 蕪湖 241000 Anhui Normal University,Wuhu 241000,China.

G804.5

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