功勞木中生物堿類成分抗氧化活性研究

朱姮，文蕾，耿巖玲，王曉，賈文婷，王岱杰*，延云洪

(1.山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2. 山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室，山東省分析測試中心，山東 濟南 250014；3. 山東省濟南第九中學，山東 濟南 250022)

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【中藥與天然活性產(chǎn)物】

功勞木中生物堿類成分抗氧化活性研究

朱姮1，文蕾1，耿巖玲2，王曉2，賈文婷2，王岱杰2*，延云洪3

(1.山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2. 山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室，山東省分析測試中心，山東 濟南 250014；3. 山東省濟南第九中學，山東 濟南 250022)

利用DPPH法測定功勞木中生物堿成分的抗氧化活性，采用pH-區(qū)帶精制逆流色譜分離出小檗堿、藥根堿、巴馬汀、非洲防己堿和千金藤寧堿5種成分。通過測定功勞木總生物堿以及單體生物堿成分對DPPH自由基清除力，來評價功勞木中主要生物堿類成分的體外抗氧化能力。結(jié)果顯示，在0～25 μg/mL范圍內(nèi)DPPH溶液濃度與吸光度呈線性正相關(guān)關(guān)系。功勞木總生物堿、小檗堿、藥根堿、巴馬汀、非洲防己堿以及千金藤寧堿的半抑制濃度(IC50)依次為0.07、0.32、0.24、0.20、0.18、0.59 mg/mL。因此，功勞木生物堿類成分具有一定的抗氧化能力，且隨生物堿濃度的升高而增強，總生物堿抗氧化能力強于單體成分。功勞木生物堿抗氧化活性可能為協(xié)同效應(yīng)。

功勞木；生物堿；抗氧化活性

功勞木為小檗科植物闊葉十大功勞Mahoniabealei(Fort.) Carr.或細葉十大功勞Mahoniafortunei(Lindl.) Fedde的干燥莖[1]，其性味苦、寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效，主治濕熱瀉痢、黃疸尿赤、目赤腫痛、胃火牙痛和瘡癤癰腫等癥[2]。功勞木中生物堿類化合物類型主要為異喹啉類，包括藥根堿、巴馬汀和小檗堿等，異喹啉類生物堿具有抗菌、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗心律失常、抗血小板聚集、降壓和調(diào)節(jié)免疫功能等多種藥理活性[3-10]。此外，異喹啉類生物堿還具有能迅速且廣泛地分布于多個組織和器官的藥動學特征，可以很好地被機體吸收[11]。

DPPH法[12-17]是利用DPPH(1,1-Dipheny-2-picrylhydrazyl,1,1-二苯代苦肼基)的乙醇或甲醇溶液呈深紫色，在517 nm處有強吸收，加入受試樣品后，由于自由基被清除而產(chǎn)生顏色變化的特性用以表明樣品抗氧化活性的方法。目前，DPPH法已被廣泛用于自由基清除能力的定量分析[18-20]。本實驗采用DPPH法，測定功勞木中生物堿總樣以及單一生物堿成分的抗氧化活性。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料與試劑

功勞木購于安徽亳州藥材市場，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學李佳教授鑒定為小檗科植物闊葉十大功勞Mahoniabealei(Fort.)Carr的干燥莖。DPPH(95%，德國Sigma-Aldrich公司)；氯仿、甲醇、無水乙醇均為分析純(天津富宇化工)；維生素C分析純(國藥集團化學試劑有限公司)；實驗用水為超純水。

1.2 儀器

GENESYS 10S紫外可見分光光度計(美國Thermo Scientific 公司)；BSA124S分析天平(美國Sartorius 公司)；Waters e2695液相色譜儀(美國Waters公司)。

2 實驗方法

2.1 功勞木生物堿成分提取分離

功勞木2 kg，粉碎，95%乙醇回流提取3次，時間分別為2、2、3 h，趁熱抽濾。合并3次濾液，減壓蒸發(fā)至無醇味，加鹽酸調(diào)節(jié)pH為3，石油醚萃取3次除去脂溶性成分，剩余水層加稀氨水緩慢調(diào)節(jié)pH為9，靜置，過濾得沉淀10.6 g，即為所需生物堿總樣，放置冰箱冷藏保存。

利用pH-區(qū)帶精制逆流技術(shù)，溶劑系統(tǒng)為氯仿：甲醇：水(4：3：3,V/V)，上相加入60 mmol/L鹽酸，下相加入7.5 mmol/L三乙胺，流速2.0 mL/min，分離、鑒定得到小檗堿、藥根堿、巴馬汀、非洲防己堿和千金藤寧堿，純度達95%以上。

2.2 功勞木總生物堿及單體生物堿成分抗氧化活性的測定

2.2.1 繪制標準曲線

準確稱取DPPH 2.5 mg，用無水乙醇溶解，定容至100 mL，配成濃度為25 μg/mL的標準溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)，分別取0、2、4、6、8、10 mL標準溶液用無水乙醇定容至10 mL，配成濃度分別為0、5、10、15、20、25 μg/mL的標準溶液系列。測定上述6組標準溶液的吸光度，繪制成標準曲線。

2.2.2 DPPH法測定自由基清除率

根據(jù)文獻[21-24]稍作修改，精密稱取2.0 mg DPPH，用無水乙醇溶解，定容至100 mL，得20 μg/mL的DPPH溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)。分別配制功勞木總生物堿0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL，小檗堿0.10、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50、0.60 mg/mL，藥根堿0.05、0.10、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50 mg/mL，巴馬汀0.05、0.10、0.20、0.25、0.30、0.40、0.60 mg/mL，非洲防己堿0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40 mg/mL和千金藤寧堿0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00 mg/mL，作為受試樣品。實驗設(shè)置樣品組、對照組和空白組，樣品組取3 mL DPPH溶液加入10 mL比色管中，再加入2 mL受試樣品溶液；對照組取3 mL無水乙醇加入10 mL比色管中，再加入2 mL樣品溶液；空白組取3 mL DPPH溶液加入10 mL比色管中，再加入2 mL無水乙醇。3組均充分混勻，在30 ℃水浴中避光反應(yīng)30 min，冷卻至室溫，517 nm下測吸光值。每個樣品平行測定3次取平均值，陽性對照為不同濃度(0.78、1.56、3.13、6.25、12.50 μg/mL)的抗壞血酸(維生素C)溶液。

其中，A0為空白組的吸光度值；Ai為樣品組的吸光度值；Aj為對照組的吸光度值。

3 結(jié)果與分析

3.1 DPPH標準曲線的繪制

不同濃度DPPH溶液在517 nm下的吸光度標準曲線見圖1。實驗表明，在0～25 μg/mL范圍內(nèi)DPPH溶液濃度與吸光度呈線性正相關(guān)關(guān)系。用最小二乘法作線性回歸，得DPPH溶液濃度與吸光度關(guān)系曲線的回歸方程式為：A=0.021 7C-0.001 8，相關(guān)系數(shù)R2= 0.999 7。

圖1 DPPH標準曲線Fig.1 Standard curve of DPPH

3.2 功勞木總生物堿及單體生物堿成分的抗氧化活性測定

功勞木總生物堿及單體生物堿成分自由基清除力見圖2，由此可以看出，功勞木總生物堿及單體生物堿對DPPH均有一定的清除作用，且在測定的濃度范圍內(nèi)DPPH清除率隨著濃度的增加而增加?？偵飰A濃度為0.3 mg/mL時，DPPH清除率達97.29%，具有良好的抗氧化活性。各單體化合物也有較好的抗氧化活性，非洲防己堿在濃度為0.4 mg/mL時，DPPH清除率在83.28%；千金藤寧堿抗氧化活性較差，濃度為2 mg/mL時，DPPH清除率在95.07%。

由表1可以看出，功勞木總生物堿及各單體生物堿成分在測定濃度范圍內(nèi)，最大濃度達到的自由基清除率。由公式計算得，功勞木總生物堿、小檗堿、藥根堿、巴馬汀、非洲防己堿以及千金藤寧堿的半抑制濃度IC50依次為0.07、0.32、0.24、0.20、0.18、0.59 mg/mL，均低于維生素C的IC50值。其中，總生物堿抗氧化活性高于單體生物堿，非洲防己堿的抗氧化活性高于其他單體生物堿成分。

圖2 功勞木總生物堿及單體生物堿成分對DPPH自由基的清除力Fig.2 DPPH scavenging rates of total alkaloids and five monomeric alkaloids of Caulis Mahoniae

表1 功勞木總生物堿及單體生物堿成分自由基清除率比較Table 1 Comparison of radical scavenging rates of total alkaloids and five monomeric alkaloids of Caulis Mahoniae

4 結(jié)論

本文采用DPPH法對功勞木中生物堿成分進行了抗氧化活性研究，測定了功勞木總生物堿及單體生物堿成分的抗氧化活性。實驗結(jié)果表明，功勞木總生物堿及單體生物堿成分對DPPH均有消除作用，且隨著樣品濃度增大，消除DPPH的能力增強，清除能力依次為功勞木總生物堿大于非洲防己堿大于巴馬汀大于藥根堿大于小檗堿大于千金藤寧堿。功勞木總生物堿抗氧化活性明顯強于單體生物堿，推測功勞木生物堿抗氧化活性為協(xié)同效應(yīng)，其作用機理有待于進一步地研究。

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Antioxidant activity of alkaloids in Caulis Mahoniae

ZHU Heng1, WEN Lei1, GENG Yan-ling2, WANG Xiao2,JIA Wen-ting2,WANG Dai-jie2*, YAN Yun-hong3

(1. School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;2. Shandong Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality Control Technology, Shandong Analysis and Test Center,Jinan 250014, China; 3. Jinan Ninth High School of Shandong Province, Jinan 250022, China)

∶We determined antioxidant activity of alkaloids in Caulis Mahoniae by DPPH. We isolated berberine, jatrorrhizine, palmatine, columbamine and stepharanine with pH-zone-refining CCC. We also evaluated external antioxidant capability of dominant alkaloids in Caulis Mahoniae through DPPH free radical scavenging rate determination of total alkaloids and monomeric alkaloids. Results show that linear positive correlation exists for the concentration and absorbance of DPPH solution from 0 to 25 μg/mL. IC50of total alkaloids, berberine, jatrorrhizine, palmatine, columbamine and stepharanine are respectively 0.07, 0.32, 0.24, 0.20, 0.18, and 0.59 mg/mL, so alkaloids of Caulis Mahoniae has certain antioxidant capability. It will be enhanced with the increase of alkaloids concentration. Moreover, antioxidant ability of total alkaloids is higher than that of monomeric compounds. Antioxidant activity of Caulis Mahoniae alkaloids may be synergistic effect.

∶Caulis Mahoniae; alkaloids; antioxidant activity

10.3976/j.issn.1002-4026.2016.05.004

2016-04-29

國家自然科學基金(21506119)

朱姮(1990—)，碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物分離與純化。Email：sdzbzdzh@sina.com

*通信作者。Email：wangdaijie@126.com

R284.1

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