銅、汞和鉛對斑馬魚仔魚肝臟發育的影響

韓建，彭維兵，韓利文，何秋霞，張云，孫晨，王榮春，楚杰，劉可春

(山東省科學院生物研究所，山東省生物檢測技術工程實驗室，山東省生物傳感器重點實驗室，山東省科學院藥物篩選技術重點實驗室，山東 濟南 250014)

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【藥理與毒理】

銅、汞和鉛對斑馬魚仔魚肝臟發育的影響

韓建，彭維兵，韓利文，何秋霞，張云，孫晨，王榮春，楚杰，劉可春*

(山東省科學院生物研究所，山東省生物檢測技術工程實驗室，山東省生物傳感器重點實驗室，山東省科學院藥物篩選技術重點實驗室，山東 濟南 250014)

以肝臟綠色熒光轉基因斑馬魚T3(lfabp:EGFP)為模型，研究水環境典型重金屬污染物銅(CuCl2)、汞(HgCl2)和鉛(Pb(Ac)2)在較低濃度暴露下對仔魚(72～144 hpf)肝臟發育的影響。結果顯示，各暴露組存活率均在95%以上；CuCl2和HgCl2在1 μmol/L時均能夠引起鰾發育或充氣異常；3種化合物均能夠顯著減小肝臟熒光面積和光密度。相同暴露濃度下，CuCl2抑制肝臟發育的能力強于Pb(Ac)2和HgCl2，但HgCl2在0.01 μmol/L時就能夠顯著抑制肝臟發育；CuCl2和Pb(Ac)2抑制lfabp表達量的能力強于HgCl2，且Pb(Ac)2在0.01 μmol/L時就能夠顯著抑制lfabp表達。結果表明，3種重金屬化合物均能夠顯著抑制肝臟發育；轉基因斑馬魚仔魚可以作為檢測環境污染物肝臟發育毒性的首選模型。

銅；汞；鉛；斑馬魚；仔魚；肝臟發育

重金屬是水環境中的典型污染物，目前水體突發性重金屬污染事故時有發生，主要的污染物有銅、汞、鉛、鎘、鉻和鎳等[1-2]。水環境重金屬污染嚴重威脅水生生物健康和生存，魚類作為水環境中較大的脊椎動物類群，重金屬污染物對其產生的危害引起越來越多的關注[3-4]。魚類胚胎、仔魚期等早期發育階段對重金屬污染較為敏感，以此為動物模型開展了許多相關的毒理學研究，且主要集中于急性毒性評價方面，暴露濃度水平一般在數百微克每升或數十毫克每升級別，評價指標包括致死率、孵化率以及水腫、脊柱彎曲等[5-10]。然而重金屬污染物在水體中的含量相對較低，一般在100 μg/L以下[11-13]，其在低劑量下對亞個體水平(如器官、組織水平等)產生的毒性效應尚不清楚。肝臟是魚體重要的代謝和解毒器官，為魚類早期階段發育提供能量并降低外源毒物的毒性效應，而重金屬對魚類早期階段肝臟發育的影響尚不明確。因此，開展較低劑量重金屬暴露對魚類早期肝臟發育影響的研究具有重要意義。

斑馬魚(Daniorerio)是良好的實驗動物模型，已被廣泛應用于藥物毒理學、生態毒理學、環境監測以及疾病研究等科研領域[14-18]。與細胞及哺乳類實驗動物相比，斑馬魚及其胚胎在肝臟毒性方面的應用更加符合國際上倡導的毒理實驗3R原則(Replacement, Reduction and Refinement)[19]。隨著諸多轉基因模型的建立，斑馬魚在相關研究領域的應用變得更加廣泛。張云等[20]以發育72 hpf 的肝臟熒光轉基因斑馬魚仔魚Tg(lfabp:EGFP)為模型，研究了對乙酰氨基酚對仔魚肝臟的毒性。端正花等[21]也以肝臟轉基因斑馬魚Tg(lfabp10a: dsRed; elaA:EGFP)為模型，研究了環境中苯并三唑及其衍生物與重金屬鎘對斑馬魚的單獨與聯合肝臟毒性效應。Zhang等[22]發現對乙酰氨基酚、利福平和阿司匹林等肝臟細胞損傷毒性物質的暴露與轉基因斑馬魚品系Tg (lfabp10a: dsRed; elaA: EGFP)肝臟熒光量表達的降低存在顯著的劑量-效應關系。

本文選取典型重金屬化合物氯化銅(CuCl2)、氯化汞(HgCl2)和醋酸鉛Pb(Ac)2作為研究對象，以肝臟熒光轉基因斑馬魚為模型，研究了3種重金屬化合物在低濃度暴露下對斑馬魚仔魚肝臟發育的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗魚及胚胎

本實驗采用肝臟綠色熒光轉基因斑馬魚T3(lfabp:EGFP)，具體養殖和繁殖操作參照文獻[23]方法。成魚在28 ℃、照明/黑暗(14/10 h)條件下分開飼養，每天定時投喂顆粒餌料和活豐年蝦。于實驗開始前一天下午，取健康性成熟的T3斑馬魚，按雌雄1∶2的比例放入交配缸內，雌雄用隔板分開，次日燈光開啟后抽隔板，雌雄追尾交配產卵。收集受精卵并用亞甲基藍溶液消毒，再用胚胎培養水清洗后培養，光照周期和培養溫度同成年斑馬魚。每天換新鮮培養水，并及時將死卵和卵殼清除。養至72 hpf，依據國家標準GB/T 21807—2008化學品 魚類胚胎和卵黃囊仔魚階段的短期毒性試驗[24]對孵化、存活和畸形情況進行評價。在相關指標符合國標要求的條件下，挑選孵化出的健康個體進行后續暴露實驗。

1.2 試劑及儀器

考慮到暴露液濃度穩定性和均一性，本實驗重金屬均選用其易溶性鹽或其鹽的水合物。HgCl2(純度99.9%)購自西亞化學工業有限公司； Pb(Ac)2·3H2O(純度99.998%)和CuCl2·2H2O(純度99.99%)均購自Aladdin公司。其他均為國產分析純試劑。

斑馬魚胚胎培養用水成分為0.17 mmol/L KCl，0.4 mmol/L CaCl2，5 mmol/L NaCl，0.16 mmol/L MgSO4。仔魚拍照前先用0.15 mg/L MS-222(間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽)麻醉，于4%甲基纖維素中固定拍照。

顯微觀察和拍照使用奧林巴斯(Olympus)SZX-16熒光體視顯微鏡和FSX-100多功能顯微成像工作站。斑馬魚成魚飼養系統為北京愛生科技有限公司設備，胚胎和仔魚在控溫型光照培養箱中培養。

1.3 暴露及評價方法

考慮到簡化流程和操作等要求，本研究采用已經成熟化的暴露評價方案[20]。在斑馬魚發育至72 hpf，挑選發育正常的斑馬魚仔魚，移入6 孔板中，每孔15尾仔魚。根據預實驗，設定3種重金屬化合物暴露濃度均為0、0.01、0.1和1 μmol/L，暴露液均用胚胎養殖水配制，每孔加5 mL暴露液，每個濃度組設3個平行孔。隨后于光照培養箱中恒溫(28 ℃)培養，每24 h換液一次。暴露至144 hpf時，觀察記錄各實驗組仔魚的形態和肝臟損傷情況。于FSX-100顯微鏡下對肝臟側面進行拍照，采用FSX-BSW軟件對照片進行處理，并用Image-Pro plus 5.1軟件測定肝臟熒光面積(Area)和熒光光密度(integral optical density，IOD)。

1.4 統計分析

2 結果與分析

2.1 實驗仔魚72 hpf基本指標

發育至72 hpf，仔魚存活率為90.1%，孵化率為88.8%，未見明顯畸形個體。以上數據均符合相關國家標準(GB/T 21807—2008)對斑馬魚胚胎和卵黃囊仔魚階段存活率、孵化率的要求。

2.2 重金屬暴露對仔魚存活和形態的影響

經過72～144 hpf暴露，不同處理組仔魚的存活率和畸形率結果見表1。對照組存活率為100%。染毒組存活率均在95%以上，與對照組相比無顯著性差異。對照組個體無畸形現象出現；CuCl2和HgCl2最高濃度組畸形率分別為71.1%和20.0%，表現為無鰾或鰾不充氣狀態，與對照組相比差異極顯著。其余組亦有部分個體無鰾或鰾不充氣，但無統計學差異。

表1 CuCl2、HgCl2、Pb(Ac)2和對照組仔魚在144 hpf時的存活率和畸形率Table1 Survival and malformation rates of CuCl2, HgCl2, Pb(Ac)2 and control groups at 144 hpf

為了更為直觀地展現染毒組畸形個體的形態，我們對各組異常個體進行了相差顯微拍照記錄。如圖1所示，對照組個體形態正常，仔魚發育良好(A)，白色箭頭所指部位從左到右依次為鰾、腸和肝臟；而CuCl2-1 μmol/L組部分個體無鰾(B和C)，肝臟和腸道出現病變(B，白色箭頭指示部位)，體表出現類似增生(C和D，白色箭頭指示部位)。

A 對照組個體；B、C、D均為CuCl2-1 μmol/L組，其中B為無鰾且肝臟異常個體，C為無鰾、增生個體，D為有鰾、增生個體圖1 對照組和CuCl2-1 μmol/L組仔魚144 hpf時的形態Fig.1 Morphology of larvae at 144 hpf in control and CuCl2-1 μmol/L groups

2.3 重金屬暴露對肝臟發育的影響

通過熒光顯微觀察，檢測重金屬暴露對肝臟發育和lfabp表達情況。與對照組相比，重金屬暴露導致肝臟顯著減小。如圖2所示，圖中列出了對照組和各重金屬最高濃度組個體的明視場-熒光疊加圖片，白色箭頭所指部位為肝臟，從圖中可以看出暴露組肝臟熒光面積和亮度明顯減小。

圖 2 CuCl2、HgCl2、Pb(Ac)2最高濃度組和對照組的肝臟熒光圖片Fig.2 Liver fluorescence images of the highest dose groups of CuCl2, HgCl2, Pb(Ac)2 and control groups

對各個處理組的部分個體進行熒光拍照，測量了肝臟側面熒光面積(Area)和熒光光密度(IOD)。如圖3所示，與對照組相比，CuCl2(0. 1和1 μmol/L)和Pb(Ac)2(0.1和1 μmol/L)暴露組肝臟熒光面積均顯著減小，且呈現一定的劑量-效應關系。如圖4所示，與對照組相比，CuCl2(1 μmol/L)和Pb(Ac)2(0.01、0.1和1 μmol/L)暴露組肝臟熒光光密度均顯著減小，且呈現一定的劑量-效應關系。HgCl2各暴露組肝臟熒光光密度也呈現減小趨勢，但無統計學差異。肝臟熒光面積結果表明，上述3種重金屬化合物暴露顯著影響了肝臟發育，導致肝臟顯著小于對照組。肝臟熒光光密度結果表明，上述3種重金屬化合物暴露顯著影響了肝臟lfabp的正常表達，從而影響了肝臟的生理學功能。相同暴露濃度下，CuCl2對肝臟發育大小的負面影響比Pb(Ac)2和HgCl2強，但HgCl2在0.01 μmol/L時就能夠顯著抑制肝臟發育；CuCl2和Pb(Ac)2抑制lfabp表達量的能力比HgCl2強，且Pb(Ac)2在0.01 μmol/L時就能夠顯著抑制lfabp表達。

圖3 CuCl2、HgCl2、Pb(Ac)2組和對照組肝臟熒光面積Fig.3 Liver fluorescence areas of CuCl2, HgCl2, Pb(Ac)2 and control groups

圖 4 CuCl2、HgCl2、Pb(Ac)2組和對照組肝臟熒光光密度(IOD)Fig.4 Liver fluorescence IOD of CuCl2, HgCl2, Pb(Ac)2 and control groups

3 討論

本研究豐富了轉基因斑馬魚在快速評價肝臟發育毒性方面的應用，能夠為評估不同重金屬化合物對水生脊椎動物早期發育階段的肝臟毒性提供參考，為綜合評價水環境重金屬污染物的毒性效應和環境健康風險提供了科學依據。本文以肝臟綠色轉基因熒光斑馬魚T3(lfabp:EGFP)為模型，研究了3種重金屬化合物(CuCl2、HgCl2和Pb(Ac)2)在不顯著引起死亡率上升的濃度下對仔魚肝臟發育的影響。發育至72 hpf的仔魚存活率和孵化率均滿足相關標準要求，為實驗結果的可靠性提供了保障。經過72～144 hpf暴露期后，各組存活率均在95%以上，與對照組相比無顯著性差異。1 μmol/L的CuCl2和HgCl2暴露能夠分別引起71.1%和20.0%的個體無鰾或鰾不充氣，這與之前文獻報道的2.56 μg/L CuSO4暴露引起65.6%個體鰾缺失的結果類似[25]。

與以往單純測量熒光強度不同[20-21]，本研究分別對肝臟側面熒光面積和熒光密度進行了測量。熒光面積大小代表肝臟發育大小，熒光密度強弱代表lfabp表達量的高低，間接反映了肝臟功能發育是否完善。Cu、Hg和Pb都能夠顯著減小肝臟熒光面積，說明3種重金屬化合物均能夠顯著抑制肝臟的發育。斑馬魚肝型脂肪酸結合蛋白相關基因lfabp是脂肪酸結合蛋白家族(L-FABP)的重要成員之一,L-FABP不但可轉運脂肪酸,為細胞生長提供能源及原材料,還可以結合和轉運各種配體、參與細胞內的信號轉導、影響有絲分裂,同時還具有抗氧化的功能[21]。Cu和Pb能夠顯著抑制lfabp的表達。雖然Hg的抑制作用無統計學差異，但抑制趨勢呈現一定的劑量效應關系。通過分析可以得出，3種重金屬化合物都具有抑制仔魚肝臟正常生理功能的作用，肝臟細胞受到不同程度的損傷，不同金屬的毒性特點不一樣，且Pb的抑制作用強于Cu和Hg。

在72 hpf時仔魚肝臟基本形成，此后肝臟會繼續長大[26]。為了便于實驗操作，并結合之前本方案的成功應用經驗[20]，本研究選擇的暴露期為72～144 hpf。這個時期內肝臟將行使代謝功能，消化吸收卵黃囊的營養物質，肝體繼續長大，有利于特定考察重金屬對肝臟發育和功能的影響。考慮到持續暴露對肝臟分化發育的影響，以及選擇更加敏感的暴露窗口期，今后的實驗將會對1 hpf內的胚胎進行暴露，直到72 hpf或144 hpf，與本文獲得的實驗結果進行比較，篩選出更加高效的暴露方案。

轉基因斑馬魚模型在快速評價化學品毒性方面具有顯著優勢。通過建立多種器官、靶點特異的熒光轉基因品系，優化毒性篩選方案，并結合分子毒理致毒機制研究，將為實現快速、高效的污染物毒理學評價和環境健康風險評估提供有力保障。此外，實際水環境中的污染物種類繁多，且多種同時存在于同一水體中，構成復合污染。目前基于魚類胚胎/仔魚模型的復合暴露毒性評價指標也仍然停留在死亡率、孵化率和畸形率等一般急性毒性指標上[21,27-28]。通過優化復合暴露方法和檢測指標，提高在復合暴露毒性評價中應用相關轉基因斑馬魚品系的可行性，從而加快對多種污染物復合暴露的風險評價，將成為下一階段的重點研究方向。

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Impact of Cu,Hg and Pb on liver growth of zebrafish larvae

HAN Jian, PENG Wei-bing, HAN Li-wen, HE Qiu-xia, ZHANG Yun,SUN Chen, WANG Rong-chun, CHU Jie, LIU Ke-chun*

(Shandong Provincial Engineering Laboratory for Biological Testing Technology, Shandong Provincial Key laboratory of Biosensors,Key Laboratory for Drug Screening Technology of Shandong Academy of Sciences, Biology Institute,Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China)

∶We addressed the impact of three typical heavy metal pollutants (copper chloride, mercury chloride and lead acetate) on liver growth of zebrafish larvae (72～144 hpf) with a liver green fluorescence transgenic zebrafish T3 (lfabp:EGFP) as a model. Results show that the survival rates of all groups are all more than 95%. CuCl2and HgCl2of 1 μmol/L can all cause abnormality of swimbladder growth or inflation. The three heavy metal compounds can all significantly reduce liver fluorescence area and integral optical density. CuCl2has more powerful inhibition capability for liver growth than Pb(Ac)2and HgCl2under identical exposure concentration. However, HgCl2of 0.01 μmol/L can inhibit liver growth. Inhibition capability oflfabpexpression of CuCl2and Pb(Ac)2is greater that of HgCl2. Moreover, Pb(Ac)2of 0.01 μmol/L can inhibit the expression oflfabp. Results show that the three heavy metal compounds can all significantly inhibit liver growth. Transgenic zebrafish larvae can serve as priority model for detection of environmental contaminants caused liver growth toxicity.

∶copper; mercury; lead; zebrafish; larvae; liver growth

10.3976/j.issn.1002-4026.2016.05.009

2016-07-14

山東省科學院青年基金(2015QN012)；山東省自主創新及成果轉化專項(2014ZZCX02105);山東省自然科學基金三院聯合基金(ZR2015YL013)

韓建(1983—)，男，博士，助理研究員，研究方向為毒理學和藥物篩選。Email:hanjian251314@163.com。

*通信作者，劉可春(1964—)，男，博士，研究員，研究方向為藥物篩選。Email:hliukch@sdas.org。

R965.1

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