異煙肼對斑馬魚幼魚發育毒性及運動行為學的影響

鄒玉，張云，韓利文，何秋霞，李智平, 3，侯海榮，韓建，王希敏，李娟娟, 3，岑娟，劉可春*

(1.山東省科學院生物研究所，山東省生物檢測技術工程實驗室，山東省生物傳感器重點實驗室，山東省科學院藥物篩選技術重點實驗室，山東 濟南 250014；2.河南大學，河南省天然藥物與免疫工程重點實驗室，河南開封 475001；3山西醫科大學，山西 太原 030000)

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【藥理與毒理】

異煙肼對斑馬魚幼魚發育毒性及運動行為學的影響

鄒玉1, 2，張云1，韓利文1，何秋霞1，李智平1, 3，侯海榮1，韓建1，王希敏1，李娟娟1, 3，岑娟2*，劉可春1*

(1.山東省科學院生物研究所，山東省生物檢測技術工程實驗室，山東省生物傳感器重點實驗室，山東省科學院藥物篩選技術重點實驗室，山東 濟南 250014；2.河南大學，河南省天然藥物與免疫工程重點實驗室，河南開封 475001；3山西醫科大學，山西 太原 030000)

以斑馬魚幼魚為研究對象，研究異煙肼對幼魚發育毒性和行為學的影響。 用不同濃度的異煙肼分別處理發育至72 hpf的斑馬魚幼魚，觀察幼魚的死亡率、畸形率及形態變化，分析幼魚行為學軌跡。 異煙肼(≥4 mmol/L)對斑馬魚幼魚有致死作用，隨著濃度的增加和作用時間延長而增強。異煙肼對斑馬魚幼魚的發育過程有致畸作用，表現為脊柱彎曲、卵黃囊吸收延滯、心包水腫、魚鰾缺失、體長發育延遲和器官空泡化等。隨著給藥濃度的增加和作用時間的延長，異煙肼組幼魚行為軌跡減少，運動次數和運動速度顯著降低。結果表明，異煙肼(≥4 mmol/L)對斑馬魚幼魚具有致死和致畸作用，對幼魚的運動行為有抑制作用，并且呈現時間和劑量依賴性。

異煙肼；斑馬魚；發育毒性；行為學

結核病是一種由結核桿菌引起的常見致命傳染病，據世界衛生組織統計，全球每年結核病患者新增人數達到900萬，已成為威脅人類健康的主要疾病之一，而且我國屬于結核病高發地區[1-2]。1952年首次合成的抗生素異煙肼(Isonicotinic acid hydrazide，INH)，因其對結核分枝桿菌具有高度選擇性，開始用于抗結核病的治療。INH的性質穩定，抗菌力強，療效高、口服方便且價廉，已成為目前一線臨床治療結核病的藥物[3-4]。

斑馬魚是一種小型熱帶脊椎動物，不僅具有與人類基因組約87%的同源性[5]，而且有個體小、產卵多、發育快、體外受精、胚胎透明、易于觀察以及飼養簡便等優點[6]。與傳統的實驗動物大、小鼠相比，斑馬魚實驗操作簡便、節省受試藥物的用量、減少培養實驗動物的時間和成本，從而有助于研究疾病的發生和藥物的毒理機制[7]。斑馬魚作為一種體內實驗模式動物，它的發育在心血管、體節、肌肉、骨骼和神經系統方面與哺乳動物具有高度相似性，現已廣泛應用于藥物的發育毒性篩選和機制研究中。

臨床發現，INH在持續使用過程中，具有一定的毒副作用[8]，可引起病人產生各種不良反應，如肝毒性、周圍神經炎、胃腸道反應、內分泌失調、過敏和中樞神經系統并發癥等[9-10]。INH可通過胎盤使胎兒血藥濃度高于母體，但INH對胎兒和新生兒的發育毒性并未見報道。因此，本研究以斑馬魚幼魚為發育毒性評價模型，探討INH對斑馬魚幼魚發育和運動行為學的影響，科學評價INH對幼魚的發育毒性，為指導孕產婦及新生兒臨床合理用藥提供科學依據。

1 實驗材料與儀器

1.1 試劑

INH(Fluka公司)使用斑馬魚養殖水溶解稀釋。斑馬魚養殖水的配方為5 mmol /L NaCl、0. 17 mmol /L KCl、0. 4 mmol /L CaCl2和0. 16 mmol /L MgSO4。三卡因(Sigma公司)使用純凈水配成質量分數0.16%的溶液，4 ℃冰箱保存備用。

1.2 實驗儀器

zebrabox斑馬魚行為分析儀(Viewpoint公司)；體視熒光顯微鏡SZX16(Olympus公司)；DP2-BSW圖像軟件(Olympus公司)；斑馬魚飼養養殖系統(北京愛生科技有限公司)；Forma 3111型水套式CO2培養箱(Forma公司)。

1.3 實驗動物

AB野生型斑馬魚由山東省科學院斑馬魚藥物篩選平臺提供，斑馬魚的飼養和繁殖參照文獻中已有的成熟方法[11]。斑馬魚的培養在光循環為14 h 光照和10 h 黑暗、pH為7.0左右、溫度為28 ℃左右的環境中。實驗前一天16：00，將健康的斑馬魚放在缸內交配，雌雄比例為1∶1或1∶2，次日8：30抽取隔板，0.5 h后收集受精卵。用養殖水對受精卵清洗3遍，然后用亞甲基藍溶液對受精卵進行消毒，后移入干凈的斑馬魚養殖水中28 ℃左右控光培養。

2 實驗方法

2.1 INH與斑馬魚幼魚共孵育

將受精后72 hpf(hours post fertilization)的斑馬魚放在培養皿中，在顯微鏡下挑選發育正常的幼魚于6孔板中，每孔30尾幼魚。實驗中INH的濃度分別設置為1、2、4、6、8、16 mmol/L(養殖水配制)和空白對照組(養殖水)，每孔給予不同濃度的INH暴露液5 mL，每個濃度組分別設置3個重復孔，給藥后放在28 ℃恒溫培養箱中繼續控光培養。連續藥液暴露3 d，每24 h更換藥液，并去除死亡幼魚。

2.2 斑馬魚幼魚發育觀察和記錄

分別在給藥24、48、72 hpe(hours post exposure)時記錄斑馬魚死亡數和畸形數，然后計算其死亡率、畸形率。使用三卡因麻醉幼魚后，在體視熒光顯微鏡下拍照觀察，并記錄斑馬魚形態變化。

2.3 行為學實驗

方成的多幅作品，為中國美術館收藏，并出版有《方成漫畫選》《方成連環漫畫集》《幽默漫畫》，以及文集《漫畫入門》《笑的藝術》《幽默·諷刺·漫畫》等著作。人們公認，鮮明的思想性，是他作品的重要特點。

斑馬魚幼魚行為學實驗操作參考文獻[12]，將INH(1、2、4、6、8、16 mmol/L)不同濃度組和空白對照組，分別放在48孔板中，每孔一尾發育至72 hpf的幼魚，每孔加入相應濃度藥液和養殖水500 μL，每個實驗組設置6尾幼魚，將48孔板放入培養箱中繼續控光培養，于24、48、72 hpe放入斑馬魚行為學分析系統的暗箱中，使用zeblab 軟件分別采集 10 min內各組幼魚的運動軌跡，利用軟件導出總游行距離和游行時間，然后計算每組魚游行平均速度、平均距離、快中慢運動對應時間和次數，各數值分別計入統計。

2.4 數據分析

3 結果與分析

3.1 INH對斑馬魚幼魚死亡率的影響

觀察斑馬魚幼魚的死亡情況，空白對照組和1 mmol/L組在給藥3 d內均無死亡現象。給藥24 h后，各給藥組與對照組相比，死亡率未見顯著性差異(P>0.05)；給藥48 h后，6、8、16 mmol/L組死亡率開始明顯升高；給藥 72 h后，6、8、16 mmol/L組幼魚發生顯著性死亡，16 mmol/L組死亡率達到80 % 以上，見圖1。

3.2 INH對斑馬魚幼魚發育畸形的影響

給藥24 h后，與空白對照組相比，6、8、16 mmol/L組均出現畸形；給藥48 h后，較高濃度(≥4 mmol/L)組畸形率升高明顯；給藥72 h后，2 mmol/L組幼魚也出現畸形，8、16 mmol/L組的致畸作用顯著，見圖2。

圖1 INH對斑馬魚幼魚劑量-時間-死亡率的影響。Fig.1 Impact of INH on dose-time-death rate of zebrafish larvae

圖2 INH對斑馬魚幼魚劑量-時間-畸形率的影響。Fig.2 Impact of INH on dose-time-malformation rate of zebrafish larvae

3.3 各暴露階段的斑馬魚圖像記錄

顯微鏡下記錄各個劑量、各個時間段INH對斑馬魚幼魚形態的影響。正常發育斑馬魚幼魚如圖3所示，靜止狀態下，從頭至尾呈現一條直線，各臟器形狀完整，魚鰾發育正常，體節清晰可見，色素沉淀均勻。

UJ 前顎； B 腦； SB 魚鰾； NC 脊索； S 體節； T 尾； LJ 下鄂 ； H 心臟； L 肝臟； ST 胃； Y 卵黃； I 腸； E 眼； ALJ 前端下鄂； H 心臟； PF 胸鰭圖3 正常斑馬魚側面和腹面形態圖(5 dpf )。Fig.3 Lateral and ventral view of a normal 5 dpf zebrafish.

如圖4所示，暴露至24 hpe時,與空白對照組相比，6、8、16 mmol/L組均出現畸形，表現大多為心包水腫、身體脊柱彎曲、尾部變形、身體側傾和發育遲緩，且隨著給藥劑量增加，致畸作用更加明顯。暴露至48 hpe時，對照組斑馬魚形態正常，游動活躍；較高濃度組(≥6 mmol/L)畸形現象加劇，斑馬魚較不活躍，多側躺于培養板底部，尤其是16 mmol/L組斑馬魚不游動，沉于板底；≥6 mmol/L組幼魚發育畸形主要表現為心腹水腫、魚鰾未發育、體軸不對稱、和脊柱彎曲嚴重，體長與對照組相比也較短。暴露至72 hpe時，對照組斑馬魚形態正常，游動活躍；2 mmol/L組也出現水腫現象，4 mmol/L組斑馬魚出現脊柱彎曲、水腫現象，魚鰾縮小，16 mmol/L組甚至出現尾巴畸形、魚唇和鰭不發育以及體節形成遲滯等，且隨著給藥劑量增加，斑馬魚身體扭曲程度加劇，心腹水腫加劇，見圖5。

圖4 INH對斑馬魚幼魚發育形態學的影響Fig.4 Impact of INH on morphology variation of zebrafish larvae

圖5 暴露于不同濃度INH的斑馬魚幼魚形態圖(72 hpe)。Fig.5 Morphology variation of zebrafish larvae exposed to different concentrations of isonizid (72 hpe)

3.4 INH對斑馬魚運動行為的影響

連續暴露INH 3 d，實驗記錄斑馬魚幼魚的行為軌跡，軌跡時間設定為10 min。結果如圖6所示，低劑量(1～4 mmol/L)暴露組幼魚與空白對照組幼魚相比，自發運動軌跡無顯著性差異。隨著給藥濃度的增加和給藥時間的延長，高劑量組(≥6 mmol/L)幼魚越來越不活潑，觸壁反射活動減少，行為軌跡變短，說明高劑量INH組對斑馬魚幼魚的運動行為有明顯的抑制作用。

行為學實驗研究參數包括每條魚自發運動總距離，每組魚平均自發運動總距離和平均速度，快速、中速、慢速運動次數以及快速、中速、慢速運動時間，自發運動參數分析(10 min)如圖7所示。與空白對照組比，1 mmol/L組在暴露時間內，各研究參數無差異性，幼魚運動活潑，主要以慢速和快速游動； 2 mmol/L組主要以慢速游動，慢速運動時間和頻率無差異性，中速運動時間和次數稍微減少； 4 mmol/L組在給藥48 h內行為學參數無差異性，在給藥72 h時，運動總距離和平均速度、慢速運動速度和次數都有顯著差異； 6 mmol/L組在給藥24 h內行為學參數無差異性，48 h、72 h時，運動參數出現差異性；高劑量組(≥8 mmol/L)低速運動，運動距離、運動時間和運動次數顯著降低，說明幼魚活動減少，行為受抑制。

圖6 暴露于不同濃度INH的斑馬魚行為軌跡圖Fig.6 Behavior trajectory of zebrafish larvae exposed to different concentrations of isonizid.

圖7-1 INH對斑馬魚行為學的影響。Fig.7-1 Impact of isonizid on the behavior of zebrafish larvae

圖7-2 INH對斑馬魚行為學的影響。Fig.7-2 Impact of isonizid on the behavior of zebrafish larvae

4 討論

INH作為重要的一線抗結核藥，對細胞內外的結核分枝桿菌都有顯著的抑制作用，但是，在結核病的治療過程中，患者易出現INH造成的不良反應或者耐藥性，從而影響了結核病的治療[13]。INH的毒性作用機制至今尚不明確，有研究認為INH導致機體損傷的機理可能與線粒體氧化損傷有關，其代謝產物形成氧化應激反應，引起線粒體中的酶失活，造成線粒體損傷，進而影響細胞的正常能量代謝，造成細胞的大量凋亡，形成機體損傷[14]。

斑馬魚胚胎及其幼魚用于研究藥物的發育毒性具有獨特優勢，其具有體外受精、繁殖周期快、易于飼養和前期胚胎整體透明等優點[15-16]。斑馬魚幼魚運動行為測定方便、快捷和經濟，比起器官質變后病理學的檢查，能更直觀地反應幼魚的行為狀態和發育的健康程度，行為活動是評價藥物毒性最敏感的指標[17-18]。

本實驗采用不同濃度組INH(0、1、2、4、6、8、16 mmol/L)，對斑馬魚幼魚持續暴露72 h，并記錄幼魚的死亡率、畸形率和運動行為學軌跡。結果表明，本實驗條件下，INH 的最大無毒性劑量為2 mmol/L，低劑量(1～4 mmol/L)的 INH 對斑馬魚幼魚發育毒性較低，隨著給藥劑量的增加和給藥時間的延遲，幼魚的死亡率和畸形率呈現劑量和時間依賴性，造成脊柱彎曲和心腹水腫等多種毒性效應。本實驗分析了10 min斑馬魚幼魚行為軌跡，根據行為軌跡的運動速度劃分為3個速度范圍：低速(<1.0 cm/s)、中速(1.0 ～6.0 cm/s)和高速(>6.0 cm/s)，結果發現，隨著INH濃度的增高， 斑馬魚幼魚的運動軌跡、運動速度和運動次數逐漸減少，高劑量(≥6 mmol/L)INH對斑馬魚幼魚的運動行為有明顯抑制作用。

目前，關于INH的發育毒性及其作用機制研究仍處于初步探索階段。本研究初步探討了INH對斑馬魚幼魚發育和運動行為學的影響，為進一步闡明其發育毒性作用機制奠定了基礎，為指導臨床合理用藥、促進其發揮疾病治療作用起著重要作用。

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Impact of isoniazid on developmental toxicity and behavior of zebrafish larvae

ZOU Yu1,2,ZHANG Yun1,HAN Li-wen1,HE Qiu-xia1，LI Zhi-ping1,3，HOU Hai-rong1，HAN Jian1，WANG Xi-min1，LI Juan-juan1,3，CEN Juan2*，LIU Ke-chun1*

(1.Shandong Provincial Engineering Laboratory for Biological Testing Technology, Shandong Provincial Key laboratory of Biosensors,Key Laboratory for Drug Screening Technotogy of Shandong Academy of Sciences, Biology Institute, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China; 2. Henan Provincial Key Laboratory of Natural Medicine and Immune-Engineering,Henan University, Kaifeng 475001, China;3. Shanxi Medical University, Shanxi 030000, China)

∶We investigated the impact of isonizid on developmental toxicity and behavior of zebrafish larvae. Zebrafish larvae of 72 hpf growth were processed with different concentrations isonizid. We then observed their mortality, malformation rate, morphology variation and analyzed their behavior trajectory. Higher concentration isoniazid (≥4 mmol/L) has lethal effect to zebrafish larvae, which is strengthened with the increase of isoniazid concentration and action time. Isoniazid has abnormal effect on their developmental process, including spinal curvature, increased yolk sac area, pericardial edema, swim bladder loss, developmental delay of body length and organ vacuolation. The larva of isoniazid group have less behavior trajectory, lower movement number and velocity with the increase of drug concentration and action time. Results demonstrate that isoniazid (≥4 mmol/L) has lethal and abnormal effect on zebrafish larvae, and inhibiting effect on their movement behavior, dependent on dose and time.

∶ isoniazid; zebrafish larvae; developmental toxicity; behavior

10.3976/j.issn.1002-4026.2016.05.008

2016-07-13

山東省自然科學基金三院聯合基金(ZR2015YL010)；山東省科學院青年科學基金項目(2013QN001)；山東省自主創新重大專項(2014ZZCX0215)；國家自然科學基金(U1204830)；河南省教育廳科學技術研究重點項目資助計劃(13A310064)

鄒玉(1991—)，女，碩士，研究方向為腫瘤藥理學。Email:15069177320@163.com

*通信作者，岑娟， Email: cenjuan@henu.edu.cn；劉可春， Email: hliukch@sdas.org

R965.1

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