大黃素對急性肺損傷大鼠的肺泡灌洗液中TNF-α IL-1β的影響

朱詩乒 樓雅芳 蔡宛如?

·論著·

大黃素對急性肺損傷大鼠的肺泡灌洗液中TNF-α IL-1β的影響

朱詩乒 樓雅芳 蔡宛如?

目的評價大黃有效成分大黃素對急性肺損傷（ALI）的保護作用，探討其防治急性肺損傷的作用機制。方法SD大鼠40只隨機分為四組：空白對照組、模型組、溶劑組、大黃素組，每組各10只。采用氣管內滴注內毒素法制備ALI大鼠模型，溶劑組腹腔注射脂肪乳，大黃素組腹腔注射的劑量為10mg/kg，在造模前24h，造模，造模后24h內行腹腔注射給藥，空白對照組不作任何處理。在造模后48h采集標本，并且行肺組織HE染色，進行肺泡灌洗液中總細胞數及中性粒細胞計數，檢測其總蛋白含量及乳酸脫氫酶，采用酶聯免疫法檢測大鼠BALF中TNF-α、IL-1β的含量。結果相比較與模型組與溶劑組，大黃素組能顯著減輕肺間質炎性細胞浸潤，肺間質水腫，肺泡壁增厚，肺泡腔破壞程度。且可以降低肺泡灌洗液中的總細胞數和TNF-α、IL-1β（P＜0.05），但其對中心粒細胞比值及總蛋白含量影響不大（P＞0.05）；另外其可以引起BALF中的LDH升高（P＜0.05）。結論大黃素對急性肺損傷存在一定的治療作用，這可能與其降低肺組織中TNF-α、IL-1β等促炎因子，從而降低肺泡灌洗液中的總細胞數有關，但其可以引起肺泡灌洗液LDH的升高。

急性肺損傷 大黃素 腫瘤壞死因子-α 白介素-1β

急性肺損傷（ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是指心源性以外的各種肺內、外致病因素導致的急性、進行性呼吸衰竭。病死率達30%～70%［1-2］。作者前期實驗研究已經證實中藥大黃或其復方中藥制劑可以顯著減輕肺損傷大鼠肺泡結構的破壞，炎癥細胞的浸潤，減輕肺泡間隔水腫出血［3-5］。大黃素是中藥大黃的主要活性成分。相關研究證明大黃素可以對脂多糖（LPS）誘導的巨噬細胞炎癥反應具有明顯的抑制作用。2012年4月至8月作者通過動物實驗來評價大黃素對急性肺損傷的保護作用，探討其防治急性肺損傷的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠40只，清潔級，體重（200±20）g，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供。動物實驗合格證號：2011A033。

1.2 藥物與試劑 脂多糖（sigma公司進口分裝）；異氟烷（魯南貝特制藥有限公司）；炎癥因子ELISA試劑盒（美國RND公司進口分裝）；98%分析純大黃素（上海金穗生物科技有限公司）；脂肪乳（250ml：50g大豆油，3g卵磷脂）；TNF-α、IL-1βELISA試劑盒進口分裝（聯科生物有限公司）；Bradford 法蛋白濃度定量試劑盒（聯科生物有限公司）；LDH測定試劑盒（聯科生物有限公司）。

1.3 實驗儀器 大鼠灌胃器、燒杯、電子天平；液態霧化吸入裝置；高速低溫離心機；酶標儀；37℃孵育箱；-20℃冰箱；-70℃冰箱；電爐、切片機：Leica2135、自動脫水機：Tissue-Tek Vip、自動包埋機：Tissue-Tek Tec、顯微鏡：Olympus Bx5040。

1.4 動物分組及模型建立 40只大鼠采用隨機數字表法分組：空白對照組、模型組、溶劑組、大黃素組，每組10只。除了空白對照組外，其余各組均進行急性肺損傷造模。造模方法：通過液態霧化吸入裝置將異氟烷霧化，霧化麻醉SD大鼠，將老鼠頸部除毛，用碘酒擦拭消毒。在距大鼠環狀軟骨約0.5cm處作約0.3cm切口，分離氣管；將LPS配置成3mg/ml溶液，用1ml針筒吸取LPS溶液，按照1.5mg/kg劑量，緩慢注射入大鼠氣管中。然后，迅速縫合切口，再次用碘酒將切口消毒。并將大鼠左右上下搖晃，讓LPS溶液均勻分布于SD大鼠肺組織中，約1～2min后，大鼠會復蘇。空白對照組進行生理鹽水滴注處理。

1.5 給藥方法 將大黃素溶解于脂肪乳劑中，配置成1mg/ml溶液，在造模前24h，造模，造模后24h內行腹腔注射給藥，給藥劑量為10mg/kg。

1.6 標本采集 在造模后48h后，腹腔注射戊巴比妥溶液麻醉大鼠（劑量為3ml/kg），采集標本。（1）支氣管肺泡灌洗液（BALF）：打開雙側胸腔，分離氣管及肺組織，于氣管隆突上方約1cm處作一小切口后插入22號套管針，用無菌手術縫合線進行固定，結扎左上肺主支氣管，行右側及左下側支氣管肺泡灌洗。注入生理鹽水3ml，反復抽吸3次，回收BALF約2ml左右，回收率65%～70%，將灌洗后的肺泡液搖勻，抽取10μl后稀釋3倍，在細胞計數板上進行肺泡灌洗液總細胞數的計數；將剩余BALF放入離心管中，低速離心機3000r/min離心15min，取上清液，-80℃冰箱保存；將細胞沉淀涂片，進行瑞氏染色，進行細胞分類計數。（2）組織：取左肺上葉分剪三段，用于HE染色。

1.7 實驗指標檢測及方法 （1）組織病理檢查：肺組織經10%福爾馬林溶液固定24h后入全自動脫水機脫水、透明、浸蠟。經固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后進行HE染色，最終經中性樹膠封固并在光學顯微鏡下觀察肺組織病理變化。（2）BALF細胞計數：①細胞總數計數：將搖勻后的肺泡細胞灌洗液吸出10μl并稀釋3倍，用計數板四大格細胞總數，通過公式計算出BALF液中的細胞總數，計算公式如下：細胞數/ml=四大格細胞總數×4×3÷104。②細胞分類計數：將離心后的細胞沉渣用移液槍吸出約1ml，平鋪于載玻片上，待其風干后，進行瑞氏染色，計算其中性粒細胞數、淋巴細胞數及單核細胞比例。（3）大鼠BALF中TNF-α、IL-1β含量：將大鼠BALF放入離心管中，低速離心機3000r/min離心15min，取上清液，-80℃冰箱保存，經解凍后，采用酶聯免疫法（ELISA）檢測大鼠BALF中TNF-α、IL-1β含量。（4）肺泡灌洗液中總蛋白含量的測定：將大鼠BALF放入離心管中，低速離心機3000r/min離心15min，取上清液，-80℃冰箱保存，經解凍后，采用Bradford 法蛋白濃度定量試劑盒檢測大鼠BALF中總蛋白含量。（5）肺泡灌洗液中乳酸脫氫酶（LDH）的測定：將大鼠BALF放入離心管中，低速離心機3000r/min離心15min，取上清液，-80℃冰箱保存，經解凍后，按LDH測定試劑盒說明書，取樣本10pl，加入各試劑，混勻后在37℃水浴中保溫30s，在340nm處讀取初始吸光度，同時開始記時，在精確1、2、3min時，分別讀取吸光度，確定每分鐘平均吸光度變化（△A/ min），計算樣本中LDH的活性。

1.8 統計學方法 采用SPSS 19統計軟件。計量資料以（x±s）表示，正態分布數據用One-way ANOVA檢驗，予以方差齊性檢驗，進行方差齊性檢驗后，使用LSD檢驗進行組間比較；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色鏡下觀察 （1）空白組：未見明顯改變，肺泡結構多數保持完整，肺泡壁無水腫，肺間質少見炎性細胞浸潤。（2）模型組：肺間質內大量炎性細胞浸潤，肺泡腔內少量炎性細胞，肺間質水腫，肺泡間隔增寬，肺泡腔結構破壞、融合，肺泡腔及肺間質內炎性出血。（3）溶劑組：肺間質內大量炎性細胞浸潤，肺泡腔內少量炎性細胞，肺間質水腫，肺泡間隔增寬，肺泡腔結構破壞、融合，肺泡腔及肺間質內炎性出血。與模型組相似。（4）大黃素干預組：肺間質炎性細胞浸潤，肺間質水腫，肺泡壁增厚，肺泡腔破壞程度均比模型組有所減輕，各組間比較不明顯（見圖1）。

圖1 肺組織HE染色鏡下觀察

2.2 各組大鼠BALF總細胞數、N、總蛋白含量、IL-1β、TNF-α、LDH的比較 見表1。

表1 各組大鼠BALF中總細胞數比較（x±s）

3 討論

ALI是以大量彌漫性炎癥細胞肺內浸潤、肺微血管通透性增加、肺泡和肺實質內高度水腫及低氧血癥為特征的常見臨床綜合征。ALI的發病機制錯綜復雜，迄今尚未完全闡明，隨著失控的炎癥反應引起多臟器功能障礙綜合征理論的出現，使人們對ALI的發病機制轉向對炎癥損傷的認識。細胞因子是有機體產生的小分子可溶性的蛋白質，能夠影響機體細胞的行為和特征。可分為促炎因子和抗炎因子，其中TNF-α和IL-1β是炎癥損傷中比較常見的促炎因子。

ALI/ARDS中，復雜的細胞因子網絡和其他促炎化合物發動并增強了炎癥反應，過激的炎癥反應給機體帶來了不可避免的損傷［6］。其中以TNF-α和IL-1β為著。TNF-α在創傷后炎癥中是一具始動和關鍵性作用的促炎免疫分子，其能聚集激活中性粒細胞（PMN），導致呼吸爆發加劇肺損傷，其主要通過肺泡細胞的溶解，炎癥細胞在肺內遷移以及血管內皮損傷等多種途徑引起肺損傷［7-9］。而IL-1β與其具有協同作用，其共同作用在炎癥早期就能引起肺泡細胞的破壞，炎癥細胞在肺泡內的募集，從而加重肺泡蛋白滲出，肺實質的水腫，引起呼吸膜的增厚，另外激活的PMN釋放大量氧自由基［10］，直接損傷肺泡上皮及肺血管內皮細胞，導致肺毛細血管破壞，肺泡上皮細胞變性壞死，毛細血管滲漏，血漿及纖維蛋白及肺泡組織內的乳酸脫氫酶（LDH）從毛細血管滲出至肺泡，促成ALI的發生。

前期的研究證實大黃及其中藥復方（如芪冬活血飲）可以顯著減輕肺損傷大鼠肺泡結構的破壞，炎癥細胞的浸潤，減輕肺泡間隔水腫出血。其保護機制與減少前炎癥因子TNF-α的分泌，增加抗炎因子IL-10分泌，調節抗炎和促炎因子之間的平衡；減少MDA含量、增加SOD含量，具有抗氧化作用有關［3-5］。但其具體中藥單體的結果作用尚不明確，大黃素是大黃有效成分中最重要的單體。既往研究認為，大黃素對抗炎、抗腫瘤細胞增殖和轉移、抑制肝臟和腎臟纖維化等均有較強的藥理作用。研究［11-12］報道，大黃素對胰腺炎的治療作用是多層面的，除通過誘導胰腺腺胞細胞凋亡、減輕胰腺局部病損作用外，可能還具有誘導PMN凋亡，而發揮其治療胰腺炎作用。通過誘導PMN凋亡，減少PMN在多種組織器官內的積聚，對于預防或減輕胰腺炎并發SIRS、MODS具有深遠意義。

在本資料中，大黃素可以有效降低BALF中總細胞數的含量。另外，其對BALF中中性粒細胞比值及肺泡總蛋白量中均有降低作用，表明其可以有效的減少炎癥細胞的募集和肺泡滲出，這主要反映在組織病理學上，可以看到蒿本內酯組大鼠的肺間質炎性細胞浸潤，肺間質水腫，肺泡壁增厚，肺泡腔破壞程度得到改善。作者認為，與其能有效降低BALF的促炎因子（TNF-α和IL-1β）有關。相比較與溶劑組，大黃素可以降低BALF中總細胞數的含量，但其不存在統計學差異（P＞0.05），這可能和單體的濃度相關，如增加單體的給藥濃度，可能所有組別的均值將會下降，且在統計學上存在差異。另外大黃素在BALF中中性粒細胞比值上雖然無統計學差異，但其均值仍較溶劑組低，在肺泡灌洗液的蛋白含量中也是如此。在BALF的促炎因子中，大黃素無論是對TNF-α，還是IL-1β均存在降低的作用（P＜0.05）；另外，大黃素組可以引起肺泡灌洗液中LDH的升高，且較溶劑組還要高，這一點需要引起關注。因此，大黃素可以通過降低肺泡灌洗液中的總細胞數及TNF-α和IL-1β來治療急性肺損傷，但其能引起LDH的顯著升高。

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ObjectiveIn this study，to explore the rapeutic effect of the Angelica monomer “Emodin”in acute lung injury by animal experiments.Methods40 SD rats were randomly divided into seven groups：control group，model group，solvent group，and Emodin groups.Each group have 10 rats.ALI rat model prepared by Using intratracheal instillation of LPS，the solvent group by intraperitoneal injection of fat emulsion，the monomer groups by intraperitoneal injection of dose 10mg/kg in 24 hours before modeling，modeling，and 24 hours after modeling. Nothing was given in blank control group.Samples were collected 48 hours after modeling，then do lung tissue H & E staining，count the total number of cells and the rato of neutrophil in the bronchoalveolar lavage fl uid. Detect of the total protein content and lactate dehydrogenase，the enzyme-linked immunosorbent assay in BALF and various tissues of TNF-α，IL-1βcontent in BALF are also assay by ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）.ResultsCompared with the model group and the solvent group，Emodin signifi cantly reduced the infi ltration of pulmonary interstitial infl ammatory cell，edema of interstitial pulmonary，also the thickening of alveolar wall，the alveolar damage. and the total number of cells，TNF-α，IL-1βin bronchoalveolar lavage fl uid（P＜0.05）.But neutrophil ratio and total protein content not affected（P＞0.05）；In addition，it can cause the BALF LDH increased（P＜0.05）.ConclusionThe therapeutic effect of Emodin in acute lung injury may relate its decreasing important pro-infl ammatory cytokines in lung tissue like TNF-α and IL-1βwhich reduce the total number of cells in BALF. But it can cause elevated LDH in BALF.

Acute lung injury Ligustilide Tumor necrosis factor-α Interleukin-1β

國家自然科學基金項目（2012ZGG002）

310007 杭州市中醫院呼吸科（朱詩乒 樓雅芳）310005 浙江中醫藥大學附屬第二醫院（蔡宛如）

*通信作者