血漿D-乳酸對非甾體抗炎藥相關腸黏膜損害的早期診斷探討

唐凱 周新妹 吳長明 陳群 陳濤 王彩平

血漿D-乳酸對非甾體抗炎藥相關腸黏膜損害的早期診斷探討

唐凱 周新妹 吳長明 陳群 陳濤 王彩平

目的探討NSAIDs引起小腸黏膜損傷的機制，D-乳酸作為血漿標志物應用于NSAIDs腸黏膜損害的早期診斷價值。方法 雄性大鼠40只，對照組20只，對照組灌胃2 ml蒸餾水，2次/d；模型組阿司匹林片50mg/kg，2次/d，分T1（2d給藥）和T2（7d給藥）亞組，各10只。實驗后進行小腸黏膜病理損傷評分；分析緊密連接Occludin蛋白的表達；同步測定血漿D-乳酸值。結果（1）模型組呈小腸黏膜損傷病理改變，T2亞組病理評分明顯高于T1亞組（P＜0.01）。（2）Occludin/ GAPDH相對密度值模型組均較對照組明顯降低（P＜0.01），T2亞組Occludin/GAPDH相對密度值顯著低于T1亞組（t=7.646，P＜0.01）。（3）同步測定模型組血漿D-乳酸與對照組比較均明顯升高（P＜0.01），T2亞組血漿D-乳酸較T1亞組明顯升高（t=67.773，P＜0.01）。結論阿司匹林可導致大鼠小腸黏膜屏障破壞；測定血漿D-乳酸可以較早的反映NSAIDs引起的小腸黏膜損害。

血漿D-乳酸 非甾體抗炎藥 Occludin蛋白 小腸損傷

非甾體類抗炎藥（NSAIDs）具有良好的抗炎、解熱和鎮痛作用，廣泛用于關節炎及緩解疼痛癥狀，在心腦血管病預防也是基礎用藥之一。臨床重視NSAIDs引起的胃黏膜損害，而導致小腸潰瘍、出血、穿孔、腸通透性升高的副作用的發生率高、風險大，近年逐漸受到臨床關注［1］。2014年2月至2015年10月作者通過實驗研究，探討NSAIDs引起小腸黏膜損傷的機制，了解其病理生理變化，設立早期篩查指標，在發生腸并發癥之前，能夠為NSAIDs服用者提供一個便捷、可靠的非侵入性檢查方法，達到防止嚴重并發癥發生的目的。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 雄性SD大鼠40只，180～220g。由嘉興醫學院動物實驗中心提供；阿司匹林腸溶片為德國拜耳制藥公司產品，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 動物分組 采用隨機抽簽法，將40只大鼠隨機分為2組，空白對照組20只，模型組20只，每組再進一步隨機分為2d給藥和7d給藥亞組，各10只，模型組分別標注為T1亞組、T2亞組。

1.3 給藥方法 對照組以2ml蒸餾水灌胃，2次/d；模型組以阿司匹林片50mg/kg灌胃，2次/d。2d給藥對照組和T1亞組大鼠在灌胃2d后處死，7d給藥對照組和T2亞組大鼠在灌胃7d后處死。

1.4 標本制作 大鼠禁食、不禁水12h，實驗時采用10%水合氯醛3ml/kg劑量腹腔注射麻醉后處死；肉眼觀測小腸黏膜標本損傷狀況。取頸靜脈血10ml，離心后取血漿分裝，-80℃保存，用于D-乳酸的測定；在距回盲部25cm取小腸1cm，置10%甲醛液中固定，常規石蠟包埋切片，HE染色。

1.5 小腸黏膜上皮損傷程度組織病理評分 采用Chiu氏評分法分級［2］，O級：正常腸黏膜絨毛。Ⅰ級：腸黏膜絨毛頂端上皮下間隙增寬。Ⅱ級：中度固有層水腫，中央乳糜管擴張。Ⅲ級：腸黏膜上皮層細胞壞死，少數絨毛頂端脫落。Ⅳ級：部分絨毛脫落，固有層裸露，毛細血管充血。Ⅴ級：固有層崩解，出血或潰瘍形成。

1.6 Occludin蛋白檢測 過氧化物酶標記的鏈霉卵白素（SP）法檢測Occludin蛋白，按照說明書進行SP三步法進行免疫組化染色，Occludin陽性呈棕黃色顆粒狀，主要定位于小腸上皮細胞胞膜及胞質。WesternBlot檢測Occludin蛋白表達：取各組大鼠小腸組織，加入組織裂解液，勻漿后離心，取上清液，測定蛋白含量；經過凝膠蛋白電泳，光化學法顯色，拍片，以三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內參照，利用QuantiScan凝膠圖像掃描分析軟件測定電泳條帶的光密度值，計算Occludin與GAPDH光密度的比值。

1.7 血漿D-乳酸濃度測定（分光光度法） 按照試劑盒說明書操作，計算大鼠血漿D-乳酸濃度。

1.8 統計學方法 采用SPSS 13.0統計學軟件，計量資料以（x±s）表示，配對t檢驗，以P＜O.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小腸大體標本變化 對照組腸道黏膜光滑，腸管彈性好。T1亞組大鼠小腸黏膜可見散在淺表糜爛、潰瘍；T2亞組大鼠腸黏膜見多發潰瘍灶，部分有出血。

2.2 光鏡下觀察結果 對照組小腸黏膜無明顯改變，絨毛完整無脫落。T1亞組腸絨毛腫脹、增粗、縮短，部分頂端破損；T2亞組小腸黏膜明顯萎縮，固有層炎癥細胞浸潤，出現上皮細胞變性壞死、脫落，部分絨毛斷裂、脫落，固有層裸露。模型組病理評分均高于對照組（P＜O.01），T2亞組病理評分明顯高于T1亞組（P＜0.01），見圖1、表1。

圖1 各組大鼠小腸黏膜組織學表現（HE，×100）

表1 對照組和模型組大鼠小腸黏膜病理評分（x±s）

2.3 各組Occludin蛋白表達 經過免疫組化染色的病理切片顯示，對照組小腸黏膜胞膜及胞質內見明顯Occludin蛋白表達，表現為較多棕黃色細顆粒聚集；T1亞組及T2亞組較對照組均有減少，T2亞組減少更明顯。腸黏膜緊密連接Occludin蛋白的表達：Occludin/ GAPDH相對密度值T1亞組（0.507±0.051）和T2亞組（0.644±0.026）均較對照組（1.264±0.016）明顯降低（P＜0.01），T2亞組Occludin/GAPDH對密度值顯著低于T1組（t=7.646，P＜0.01），見圖2～4。

圖2 各組大鼠小腸黏膜上皮細胞Occludin蛋白表達

圖3 各組大鼠腸黏膜Occludin蛋白電泳結果（Western blot法）

2.4 血漿D乳酸檢測結果T1、T2亞組血漿D乳酸與對照組比較均明顯升高（P＜0.01），T2亞組血漿D乳酸較T1亞組明顯升高（t=67.773，P＜0.01），差異均有統計學意義。見表2。

表2 分組大鼠D-乳酸值比較（x±s）

圖4 各組大鼠腸上皮緊密連接occludin蛋白表達的不同

3 討論

NSAIDs是具鎮痛及抗炎作用的藥物，廣泛應用于各種急慢性疼痛及風濕性心血管類疾病，每年大約有20萬使用NSAIDs患者出現并發癥，病死率＞10%［3］。既往對NSAIDs的消化道損傷重點多關注在胃黏膜，但NSAIDs引起的腸道副作用的發生率高、風險大，近年逐漸受到臨床關注；NSAIDs所致的小腸黏膜早期病變多數為表淺性小潰瘍，潰瘍面與周圍黏膜界限清晰［4］，還可出現小腸出血、蛋白質丟失性腸病、腸通透性升高及穿孔等，統稱為NSAIDs相關性腸病。本資料中參照成人用阿司匹林劑量作用大鼠腸道，結果大鼠小腸黏膜有不同程度的糜爛、潰瘍等病變發生，光鏡下也有相應的病理改變。

目前NSAIDs導致腸道損害的可能機制中，炎性反應起關鍵作用，通過抑制環氧合酶活性過程中增加白三烯的生成，促進組胺、自由基釋放，造成腸道黏膜損傷［5］；腸道屏障破壞，通透性增加使小腸細胞暴露在膽汁、消化酶及細菌機會明顯增加，導致腸黏膜損傷［6］。腸黏膜機械屏障由腸道黏液層、上皮細胞、細胞間緊密連接等構成，是阻止致病物質入侵及細菌移位的屏障系統［7］，其功能的發揮需要完整的上皮細胞屏障，Occludin作為一種整體膜蛋白，是細胞間緊密連接的重要組成部分，對維持腸道上皮屏障的完整至關重要［8］。本資料中對照組大鼠小腸上皮Occludin蛋白密集表達，T1亞組及T2亞組較對照組分布均有減少，T2亞組減少更明顯；Occludin/ GAPDH相對密度值模型組均較對照組明顯降低（P＜0.01），T2亞組Occludin /GAPDH相對密度值顯著低于T1組（P＜0.01）。提示模型組大鼠腸道黏膜機械屏障遭到破壞，隨病程延長破壞加重。

在此實驗，腸黏膜屏障狀況采用了新的血漿標志物D-乳酸定量測評。一般認為，D-乳酸是細菌代謝產物，腸道中多種細菌均可產生；當腸黏膜屏障受損，腸道細菌產生的D-乳酸通過受損黏膜入血循環，哺乳動物缺乏D-乳酸脫氫酶，當腸黏膜受損早期、腸黏膜通透性增加時，血中可檢測到D-乳酸水平升高［9］。本資料中，T2亞組光鏡下腸黏膜受損更明顯，同步檢測D-乳酸水平較T1亞組明顯升高，表明D-乳酸測定較好的反映大鼠腸黏膜的受損狀況，T1亞組較對照組D-乳酸顯著升高，可早期提示大鼠腸黏膜的損害，表明血漿D-乳酸水平變化與NSAIDs引起的小腸黏膜進行性受損相關。因此，通過靜脈血檢測D-乳酸水平可反映NSAIDs所致腸黏膜損害的程度。

總之，NSAIDs可導致腸黏膜破壞，體循環D-乳酸水平相應升高，其含量與小腸黏膜損害相關。因此，D-乳酸可作為血漿標志物應用于NSAIDs腸黏膜損害的早期診斷。對于長期服用NSAIDs的患者，可進行血檢測D-乳酸篩查，發現數值升高者，再考慮安排侵入性的內鏡檢查。NSAID的小腸損害機制尚不明確，本資料中大鼠腸黏膜occludin蛋白表達減少，反映腸道屏障的破壞是機制之一，其他途徑尚需進一步研究。

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ObjectiveTo study the mechanism of NSAIDs induced intestinal mucosal injury，and the early diagnosis of D-lactate as a marker of NSAIDs in the early diagnosis of intestinal mucosal damage.Methods40 male rats，the control group of 20，the control to fi ll the stomach 2 ml distilled water twice a day；Model group aspirin 50 mg/Kg twice a day，points T1（2 day delivery）and T2 for 7 days（medicine）subgroups，10 each. After the experiment of small intestinal mucosa pathological damage score；analyze the changes of Occludin protein localizing at tight junction of intestinal epithelial cells；Simultaneous determination of D-lactate in plasma.ResultsIn the model group，the pathological changes of intestinal mucosa injury，the pathological score of T2 subgroup was signifi cantly higher than that in T1（P＜0.01）；（2）The relative density of Occludin/ GAPDH was signifi cantly lower than that in control group（P＜0.01），and the relative density of Occludin/GAPDH in T2 subgroup was signifi cantly lower than that in T1（t=7.646，P＜0.01）；（3）In the model group，the plasma D-lactate was signifi cantly higher than that in the control group（P＜0.01），and the D-lactate in the T2 subgroup was signifi cantly higher than that in the T1（t=67.773，P＜0.01）.ConclusionAspirin can cause intestinal mucosal barrier damage in rats；the plasma D-lactate can refl ect the NSAIDs induced intestinal mucosal lesion in the early.

The Plasma D-lactate NSAIDs Occludin Protein Intestinal Damage

浙江省嘉興市科技計劃項目（2014AY21035-3）

314000 浙江省榮軍醫院（唐凱 吳長明 陳群 陳濤王彩平）

314000 浙江省嘉興學院醫學院（周新妹）