層粘連蛋白配體及其受體在大鼠星形細胞及挫傷腦細胞中表達差異

賈根來 成翔 朱學芳 張鵬 陳長兵

層粘連蛋白配體及其受體在大鼠星形細胞及挫傷腦細胞中表達差異

賈根來 成翔 朱學芳 張鵬 陳長兵

目的觀察層粘連蛋白配體（LN）與層粘連蛋白受體（LN-R）mRNA在大鼠星形細胞（Astrocyte）和挫傷腦細胞（Cell of TBI）之間表達的差異，探討術中是否應盡量保存腦組織。方法從SD大鼠大腦皮層中培養星形膠質細胞，同時培養腦挫傷細胞（取自SD大鼠挫傷腦組織）。分別提取細胞總RNA，采用RT-PCR方法，分析LN和LN-R mRNA在大鼠星形細胞和挫傷腦細胞中表達的差異。結果RT-PCT檢測，大鼠星形細胞組和挫傷細胞組中均表達LN與LN-R mRNA，而挫傷腦細胞組中表達的LN和LN-R mRNA明顯上升，差異有統計學意義。結論 大鼠星形細胞和挫傷腦細胞中LN及LN-R表達存在明顯差異，考慮與誘導神經干細胞遷移和分化等有關。重型顱腦外傷手術中，在無明顯出血的情況下，應盡量保留挫傷腦組織。

層粘連蛋白配體 層粘連蛋白受體 星形膠質細胞 挫傷腦細胞

本系列課題已做的細胞遷移實驗中，作者證實LN配體及其受體表達升高，可能與誘導神經干細胞的遷移有關［1］。2013年8月至2015年5月作者通過實驗研究，觀察LN配體及其受體在大鼠腦挫傷細胞中是否表達上調，并在RNA水平進行驗證。

1 材料與方法

1.1 細胞的培養及鑒定 （1）星形膠質細胞的培養及鑒定：選用成熟SD大鼠，夾取大腦皮層組織約50mg，放入CMF-Hanks液中洗滌、靜置，用0.125%的胰蛋白酶液消化并吹打；15%小牛血清DMEM/F12培養基終止消化，離心后孵育。待細胞貼壁后，加入4%多聚甲醛1ml固定30min，0.01M PBS洗滌3次，每次10min。含10%羊血清、0.3% Triton-100的0.01M PBS液在37℃條件下孵育封閉10min。加一抗（小鼠抗GFAP IgG1，按1：500倍稀釋），放入4℃冰箱過夜，洗去一抗，用0.01M PBS洗滌3次，10min/次。加入二抗（FITC標記的羊抗小鼠IgG，按1：200倍稀釋），避光，在37℃水浴箱內孵育30min，吸去二抗，洗滌3次，10min/次。在激發光波長為490nm，濾色光波長為520nm的共聚焦顯微鏡下觀察照相。（2）大鼠挫傷腦細胞的培養與傳代：采用美國AmScien Instruments公司FP302型顱腦液壓損傷裝置，參照顱腦液壓損傷（FPI）模型制備方法，造成大鼠左側顱腦損傷。沖擊后損傷皮質均立即出現明顯血腫，表明模型制備成功。取大鼠挫傷腦細胞，用含20%小牛血清的DMEM/F12培養基培養4～6d，隔日換液1次。待細胞生長處于對數期時分別接種在2個培養瓶中繼續培養。傳代后的大鼠挫傷細胞用作提取蛋白。

1.2 RT-PCR（1）大鼠星形膠質細胞和挫傷腦細胞RNA的提?。焊魅?×107的大鼠星形膠質細胞和挫傷腦細胞至1.5ml微量離心管中，加入1ml Trizol試劑裂解，再加入氯仿200μl并振蕩15s，靜置2min。4℃離心，12000r/min，離心15min。將上層水相吸出，加異丙醇500μl。靜置10min。4℃離心，12000r/min，離心10min。棄上清液后加75%乙醇1ml洗滌沉淀。4℃離心，7000r/min，離心5min。棄凈上清液，室溫晾干沉淀。加入20μl RNase-free ddH2O，65℃水浴助溶15min。（2）紫外吸收法測定總RNA定量：采用紫外分光光度法測定RNA含量并鑒定RNA純度，RNA濃度計算公式為：RNA（mg/ml）=40×OD讀數×稀釋倍數（n）/1000。（3）逆轉錄反應（第一鏈cDNA合成）：操作步驟：在0.5ml微量離心管中，加入總RNA 2μg，然后依次加入下列試劑：2.0μl 10mol/L Oligo dT15；10×PCR buffer 2.0μl；2.0μl 5mmol/L dNTPmix；Reverse Transcriptase 1.0μl（4U/μl）。加入適量的DEPC-treated H2O使總體積為20μl。輕柔混勻，37℃孵育60min。④于70℃加熱15min以終止反應。⑤將管插入冰中，加入TE 40μl，輕柔混勻，稍離心。（4）引物設定：本實驗所用PCR引物采用在線軟件Primer 3.0，由上海博亞公司合成。引物名稱、序列見表1。

表1 引物名稱、序列

（5）擴增LN配體 及其受體：在0.2ml PCR專用Ep管中進行，在冰上依次加入下列試劑：2μl cDNA范本、2.5μl 10×PCR buffer、1.5μlMgCl2、1.0μl dNTPmix（2mmol/L）、0.5μl［Lama1上游引物（10μmol/L）、0.5μl Lama1 下游引物 （10μmol/L）］/［Rpsa上游引物（10μmol/L）、0.5μl Rpsa下游引物 （10μmol/L）］、0.5μl Taq酶（2U/μl）、16.5μl ddH2O，最后補至20μl；設置內參組（GAPDH）片段的PCR擴增條件為：大鼠脊髓總RNA RT產物（第一鏈）1μl，10×PCR Buffer 2.5μl；MgCl2（25mmol/L）2.0μl；dNTPmix（2mmol/ L）2μl；GAPDH上游引物、下游引物各1μl（10μmol/ L）；Taq DNA聚合酶0.3μl；ddH2O 16.2μl；總體積25μl；溫和混勻后離心。94℃，預變性5min；94℃，變性30s；56℃，退火30s；72℃，延伸40s。循環26次。最后72℃延伸7min。（6）PCR產物瓊脂糖凝膠電泳：在擴增DNA的Ep管中，每管取5μl，加入6×loading buf 1μl，混勻，離心，加入載樣孔，行1.5%瓊脂糖凝膠100V電泳約15min，檢測PCR產物。紫外燈下觀察并記錄結果。

1.3 統計學方法 以目的基因mRNA和內參GAPDH mRNA含量的比值作為評價指標，反復實驗3次。采用PD Quest軟件對凝膠圖像進行分析，采用stata 10.0統計分析軟件，對大鼠星形膠質細胞和挫傷腦細胞相應RT-PCR電泳條帶相對吸光度值進行t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 星形膠質細胞培養和GFAP免疫熒光檢測 見圖1、2。

2.2 總RNA的檢測 大鼠星形膠質細胞與挫傷腦細胞總RNA經甲醛變性膠電泳、EB染色，28S和18S條帶清晰可見，5S條帶隱約可見，提示RNA未降解。OD260/OD280為1.90，表明RNA純度滿意。見圖3。

2.3 LN 及其受體表達電泳 分別將大鼠星形膠質細胞和挫傷腦細胞總RNA經甲醛變性膠電泳、EB染色，GAPDH為對照，可見挫傷腦細胞中LN配體及其受體表達較星形膠質細胞明顯增加。見圖4。

2.4 LN及其受體表達變化分析 將RT-PCR電泳OD相對值（目的基因OD值/內參OD值）進行統計學分析，發現挫傷腦細胞LN配體及其受體表達量與星形膠質細胞比較，差異有統計學意義。見圖5、6。

圖1 從SD大鼠大腦皮層中分離、培養的星形膠質細胞GFAP-FITC，Common Focus （Bar=50μm）

圖2 實驗中培養的大鼠挫傷腦細胞（Bar=50μm）

圖3 總RNA電泳圖

圖4 LN及其受體表達電泳

圖5 LN配體表達變化分析

圖6 LN受體表達變化分析

3 討論

Ajioka I等［2］通過研究發現，LN是最有利于人NSC遷移的底物。Flanagan等［3］通過活體外NSC在四種不同的底物（多聚-L-鳥氨酸，纖維連接蛋白，層粘連蛋白，基質膠）上的遷移，以及其不同反應，觀察到LN能加強NSC的遷移，分化，延長細胞的存活時間。表明LN及其integrin受體是人類NSC重要的調節因子。Tate［4］通過腹前腦生殖區分離神經節隆起祖細胞（geNPC），成人紋狀體祖細胞，并做體外培養，分析在不同ECM底物上的粘附、遷移和分化能力。發現，geNPC在LN上，其粘附和遷移能力明顯加強。

重型腦外傷患者，特別是對沖性腦挫裂傷手術患者，可能在術后出現遲發性血腫。部分血腫較大，甚至形成腦疝，危及生命，影響患者的預后，需再次手術治療［5］，有時會造成醫患矛盾。多數認為，再次出血的原因較多，醫源性的因素是包括初次手術止血不嚴格，也可能與腦挫傷失活組織再次滲血相關［6］。有學者認為，挫傷腦組織完全失活，無組織學活性。且可能成為術后再出血的根源，引發醫患矛盾。因此，手術中，應將挫傷腦組織完全清除［7］。但術中挫傷腦組織清除過多，即使是部分“功能啞區”組織清除，也可能對患者的預后形成影響。加大癡呆，癲癇，昏迷等并發癥的發生幾率［8-9］。

在本實驗中，作者提取大鼠星形膠質細胞和挫傷腦細胞的總RNA進行RT-PCR反應，證實挫傷腦細胞表達高水平的LN及LN-R。結合以往實驗的結論，建議重型顱腦外傷的手術中，在無明顯活動性出血的情況下，應該盡量保留挫傷腦組織，避免過度清除挫傷的腦組織。

［1］高宜錄,張鵬,劉梅. 層粘連蛋白受體與配體在C6膠質瘤細胞中的表達及意義.蘇州大學學報(醫學版),2007,27(6)：844-847.

［2］Ajioka I,Jinnou H,Okada K,et al. Enhancement of neuroblast migration into the injured cerebral cortex using laminin-containing porous sponge. Tissue Eng Part A,2015,21(1-2)：193-201.

［3］Flanagan LA, Rebaza LM, Derzic S, et al. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J Neurosci Res,2006, 83(5)： 845-56.

［4］Tate MC, Garcia AJ, Keselowsky BG, et al. Specific bet al integrins mediate adhesion, migration, and differentiation of neural progenitors derived from the embryonic striatum. Mol Cell Neurosci, 2004,27(1)： 22-31.

［5］陸健,利文倩,黃國洲,等. 重型顱腦損傷二次手術原因及效果分析. 中國臨床新醫學,2010,9(3)：848-850.

［6］董建平,羅志偉,王和平,等. 神經外科開顱術后再次手術26例臨床分析. 昆明醫學院報,2011,12(9)：127-128.

［7］陳西亞,黃金生,陳文培,等.急診顱腦損傷術后二次手術原因與對策(附21例臨床分析).世界最新醫學信息文摘,2013,13(23)：29-30.

［8］陳偉朝,李少鵬,韓偉英. 顱腦外傷術后癲癇的預防. 中國當代醫藥,2012,19(10)：44-45.

［9］李晨,郎森陽,劉學文.顱腦外科手術前后繼發性癲癇186例臨床分析.解放軍醫學雜志,2009,34(3)：329-332.

ObjectiveTo investigate the mRNA differential expression of Laminin （LN） and its receptor LN-R between rat astrocytes and cells around the injured cortex area after TBI and explore the necessity of preservation of brain tissue around the injured cortex on operation. Method Isolated and cultured rat astrocytes and cells around the injured cortex area after TBI respectively. Total RNA was extracted. Semi-quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction（RT-PCR） method was used in detection of the expression change of LN and LN-R between rat astrocytes and cells around the injured cortex area after TBI.ResultsLN and LN-R mRNA were expressed in rat astrocytes and cells around the injured cortex area after TBI. The mRNA expression level of LN and LN-R of rat cells around the injured cortex area after TBI were higher than these of rat astrocytes，the difference was signifi cant，P＜0.05.ConclusionLN and LN-R differentially expressed in rat astrocytes and cells around the injured cortex area after TBI. We speculated this phenomenon was involved in biological process of the migration and differentiation of neural stem cells. During the operation of severe craniocerebral trauma，in the absence of obvious hemorrhage，brain tissue should be reserved as much as possible.

Laminin Laminin receptor Astrocytes Cells of traumatic brain injury

2014年江蘇省如皋市科技局科技立項課題(HS149130)

226500 江蘇省如皋市人民醫院（賈根來 朱學芳 張鵬 陳長兵）

226001 南通大學醫學院解剖實驗室（成翔）