非小細胞肺癌血內皮干細胞檢測及臨床意義

江一鳴 徐瑤 楊新妹 俞丹璐 王燕

非小細胞肺癌血內皮干細胞檢測及臨床意義

江一鳴 徐瑤 楊新妹 俞丹璐 王燕

目的探討化療對非小細胞肺癌（NSCLC）患者血內皮干細胞（cEPCs）的影響。方法51例晚期NSCLC患者紫杉醇聯合順鉑化療過程中，分別于化療前1d、化療開始后第7天、第15天和第42天用流式細胞儀檢測外周血cEPCs數量。cEPCs的分子標志物定義為CD34+/CDl33+/VEGFR-2+。結果化療周期的不同時間點外周血cEPCs數量存在差異。化療后第15天cEPCs最多（F=5.153，P=0.002），化療獲益者化療后cEPCs減少（t=3.716，P＜0.001），疾病進展者cEPCs增加（t=4.215，P＜0.001），cEPCs數量變化與化療療效相關（r=0.708，P＜0.001）。化療獲益者治療前的cEPCs數量低于化療無效者（t=5.081，P＜0.001）。結論NSCLC的化療療效與cEPCs數量密切相關；監測非小細胞肺癌患者的cEPCs有可能作為一種新的判斷預后的指標。

非小細胞肺癌 血管生成 化療 循環內皮干細胞

當前肺癌是常見惡性腫瘤的首位死因，其中絕大多數為晚期非小細胞肺癌（NSCLC）。化療是晚期NSCLC的主要治療手段，臨床獲益率為20%～50%。近年來，腫瘤的血管生成理論和抗腫瘤血管生成治療受到越來越多的重視，內皮干細胞（EPCs）與腫瘤血管生成關系密切［1］。有研究發現，NSCLC患者外周血中的循環內皮干細胞（cEPCs）增多［2］。本資料通過檢測對晚期NSCLC患者采用紫杉醇聯合順鉑化療過程中外周血cEPCs的動態變化，探討化療療效與cEPCs的關系及其臨床意義。

1 臨床資料

1.1 一般資料 2010年11至2012年9月本院收治經病理確診的晚期復發轉移的NSCLC患者51例，男34例，女17例；年齡39～73歲，中位年齡53歲。患者卡氏評分≥70，肝腎功能，心電圖和血常規均在化療規定的范圍內，患者同意接受紫杉醇聯合順鉑方案化療。排除血糖、血脂等代謝異常，近3個月內出現凝血功能異常或血栓，外傷、手術或近期有活動性出血，2年內曾明確患有動脈粥樣硬化和冠心病。

1.2 治療方法 紫杉醇175mg/m2，第1天3h內靜脈滴注，常規地塞米松、西咪替丁針等預防性抗過敏處理。順鉑，75mg/m2，分3d靜脈滴注，常規水化利尿。21d為1個周期，連續2個周期。2周期后療效評價（RECIST標準），分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、穩定（SD）和進展（PD）。不良反應根據NCICTC 2.0標準，分為0～Ⅵ°。化療后白細胞≤3×109/L時開始使用粒細胞集落刺激因子（G-CSF），至WBC≥10×109/L停止。

1.3 標本收集及制備 化療前1d（D-1）、化療后第7天（D7）、第15天（D15）及2個周期化療完成時（D42）取外周血10ml置入EDTA 抗凝管（廣州陽普公司），經過免疫熒光抗體標記標本至少45min后（標記完需避光），標本溶血，離心過濾制成細胞懸液，上機檢測。標本完成時間＜2h。

1.4 流式細胞儀檢測 以CD34+/CDl33+/VEGFR-2+為EPCs標志，檢測機器為美國貝克曼庫爾特公司PC500，溶血機器為美國貝克曼庫爾特公司TQ-Prep，方法參照文獻［3］。CD34免疫熒光抗體、EDTA及紅細胞裂解液均為美國貝克曼公司產品，CDl33、VEGFR-2免疫熒光抗體為Santa Cruz公司產品。紅細胞裂解、單細胞懸液制備及抗體溫育等操作均按說明書進行。

1.5 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件。計量資料用（x±s）表示，采用t檢驗和方差分析；療效與cEPCs的相關性采用Spearman法分析；化療、G-CSF對cEPCs的影響采用多元線性回歸分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 療效與化療過程中cEPCs數量的變化 51例患者均完成了2個周期化療。所有患者cEPCs于D-l、D7、D15和D42分別為（0.130±0.043）、（0.129±0.039）、（0.152±0.040）和（0.121±0.045），顯示cEPCs在不同時間點差異有統計學意義（F=5.153，P=0.002），其中D15最多，顯著高于D-1時（P＜0.05），D7、D42與D-1時比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。51例患者中，臨床獲益39例，其中CR 3例，PR 16例，SD20例，化療前后cEPCs分別為（0.118±0.035）和（0.095±0.027），下降明顯（t=3.716，P＜0.001）。而化療無效（PD）12例，化療前后cEPCs分別為（0.158±0.044）和（0.196±0.047），提示化療后cEPCs顯著增加（t=4.215，P＜0.001）。見圖1。與治療前比較，臨床獲益者cEPCs少于化療無效者，差異有統計學意義（t=5.081，P＜0.001）。化療2個周期后cEPCs的減少與臨床獲益相關（r=0.708，P＜0.001）。

2.2 回歸分析 將化療后測得的外周血cEPCs數量作為因變量，近期療效和G-CSF的使用情況作為自變量，進行多元線性回歸分析，變量入選模型的方法為逐步回歸法，見表1。

表1 NSCLC患者外周血cEPCs的多重線性回歸分析

3 討論

血管生成在腫瘤的進展中至關重要，當腫瘤組織生長達到一定體積時，其微環境已不能滿足其生長所需求的營養，此時會誘使腫瘤細胞啟動所謂的“血管形成開關”［4］，通過促使原血管生成蛋白的表達，使原先存在的毛細血管擴散，促進新血管形成。有研究發現骨髓來源的外周血EPCs在腫瘤血管形成中發揮重要作用，最近有多組研究在人類腫瘤血管中發現了CD133的EPCs，且多種腫瘤患者外周血中EPCs的水平上升，如乳腺癌［5］、肝癌［6］、淋巴瘤［7］等。并且已經證實，EPCs參與NSCLC的腫瘤血管生成。

圖1 NSCLC化療的近期療效與cEPCs的變化

本資料顯示，化療后第15天cEPCs數量顯著增加，較化療前和化療后第7天分別增加了16.92%和17.83%，顯示化療可能會招致EPCs大量動員、增殖、招募。作者注意到，絕大多數患者化療因骨髓抑制不同程度地使用了粒細胞集落刺激因子，而化療后第15天正處于骨髓功能抑制后的恢復期，骨髓抑制的代償和自我修復以及外源性粒細胞集落刺激因子的使用都可能促使cEPCs增加［8-9］。化療前、化療后第7天以及化療2個周期完成時，雖然cEPCs數量差異不顯著，但不同患者治療前后的cEPCs變化較大，提示化療對cEPCs的影響并不一致。進一步的亞組分析發現，臨床獲益的患者，2個周期化療后cEPCs較治療前平均減少約19%；而化療無效者，化療后cEPCs較治療前平均增加29%。作者認為，化療前NSCLC細胞大量分泌VEGF、bFGF等促血管生成細胞因子，刺激EPCs增殖并遷移至腫瘤部位，外周血cEPC數量增加。化療有效后，癌細胞生長受到抑制，促血管生成因子分泌減少，cEPCs減少；而化療無效，腫瘤失控，促血管生成因子分泌增多，加之與化療相關的血管損傷導致的代償性或修復性促血管生成因子增多，造成cEPCs進一步增多。因此，有效的化療可抑制EPCs動員入血，而無效化療則導致cEPCs動員。另外，作者在分析化療臨床獲益者和化療無效者治療前cEPCs時發現，化療無效者治療前cEPCs濃度顯著高于臨床獲益者，顯示治療前的cEPCs數量影響化療的效果。

無論化療前或化療過程中的cEPCs增多，均可能利于腫瘤血管的新生和損傷血管的修復，有助于腫瘤生長、轉移，加速病情惡化，而不利于臨床治療的獲益。因此，降低cEPCs數量，對cEPCs高的患者或在治療期間加用抗血管生成藥物，也許是一種有益的探索［10］。另外，EPCs 由于其獨特的腫瘤趨化性及在腫瘤新生血管生成中的作用，使其可能成為腫瘤基因藥物治療的最佳載體及抗血管生成治療腫瘤的靶點。隨著對EPCs生物特性及腫瘤病理機制的深入研究，EPCs 將在腫瘤診斷、治療和預測預后方面有著廣闊的應用前景。

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ObjectiveTo probe into the effects of chemotherapy on the circulating endothelial progenitor cells （cEPCs） in patients with non-small cell lung caner （NSCLC）.MethodsThe number of the peripheral blood cEPCs was determined through the flow cytometer 1 day before chemotherapy，as well as on the 7th，15th，and 42nd days after starting the chemotherapy in the 51 cases of patients with advanced NSCLC that received paclitaxel combined with cisplatin chemotherapy. The definition of the molecular marker of cEPCs was CD34+/CDl33+/VEGFR-2+.ResultsThe number of the peripheral blood cEPCs at various time points during the chemotherapy cycle showed difference. The number of cEPCs reached a peak on the 15th day after chemotherapy （F=5.153，P=0.002），that reduced in chemotherapy benefi ciaries after chemotherapy （t=3.716，P＜0.001），and that increased in those with disease progression （t=4.215，P＜0.001）；and the change of the number of cEPCs was related to the therapeutic effect of chemotherapy（r=0.708，P＜0.001）. The number of cEPCs before treatment was lower in chemotherapy benefi ciaries than in those who did not react to chemotherapy（t=5.081，P＜0.001）.ConclusionThe therapeutic effect of chemotherapy on NSCLC was closely correlated with the number of cEPCs，and monitoring the cEPCs in patients with NSCLC might be served as a novel indicator for judging the prognosis.

Non-small cell lung caner Angiogenesis Chemotherapy Circulating endothelial progenitor cells

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