穩心顆粒對AngⅡ誘導H9C2細胞肥大模型骨架蛋白的影響

任曉萌，陳 鈺，李 潔，吳麗君，楊欣宇，吳愛明，邢雁偉，商洪才，高永紅

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·基礎醫學論著/研究·

穩心顆粒對AngⅡ誘導H9C2細胞肥大模型骨架蛋白的影響

任曉萌1，3，陳 鈺2，李 潔3，吳麗君1，楊欣宇1，3，吳愛明1，邢雁偉3，商洪才1，高永紅1

目的 研究穩心顆粒(WXKL)對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導H9C2細胞肥大模型骨架蛋白的影響。方法 體外培養H9C2細胞，經血管緊張素Ⅱ誘導復制心肌細胞肥大模型，加入5 g/L穩心顆粒后，觀察細胞的形態變化以及對骨架蛋白的影響。結果 經AngⅡ誘導的H9C2心肌細胞形態發生改變，細胞橫向拉伸，腫脹變大，細胞體積較正常心肌細胞增大；加入穩心顆粒后 H9C2心肌細胞形態有所恢復，但還是比正常細胞橫向寬度增加。應用激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞形態發現，正常 H9C2細胞經10-7mol/L AngⅡ刺激48 h后，細胞形態明顯腫脹變大，細胞的長度和寬度分別由(120.32±8.36)μm和(51.82±8.62)μm增加到(182.67±7.81)μm和(92.22±7.56)μm。加入穩心顆粒作用 24 h后，AngⅡ組的H9C2心肌細胞形態有所恢復，細胞的長度和寬度為(160.35±5.66)μm、(55.87±4.52)μm。結論 穩心顆粒在AngⅡ誘導的肥厚心肌H9C2細胞模型中，能改善細胞骨架蛋白，起到一定的改善心肌肥厚的作用。

心肌肥厚；H9C2心肌細胞；血管緊張素Ⅱ；穩心顆粒

益氣活血中藥穩心顆粒(WXKL)是臨床上有確切療效治療肥厚性心律失常的中成藥。而心肌肥厚是伴隨許多心血管事件發生過程中出現的病理變化，臨床上常見的原發性或繼發性高血壓、心肌梗死、瓣膜病、先天性心臟病等都會伴有心肌肥厚的發生。雖然早期心肌肥厚是心臟為適應各種刺激而產生的心肌細胞體積增大，重量增加，有利于維持正常的心功能，但由于心肌肥厚本身也可增加心肌耗氧量、降低心肌順應性，所以長時間肥厚的程度超過心肌所能承受的范圍，會導致心力衰竭，增加猝死的發生率[1]。本實驗通過建立模擬血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導H9C2細胞肥大模型，觀察穩心顆粒對其骨架蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞 H9C2細胞株來源于大鼠胚胎期心臟組織，從中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心(Cell Resource Center，IBMS，CAMS/PUMC)，即北京協和細胞資源中心購買。購買時為第22代。

1.2 藥物 穩心顆粒(山東步長制藥股份有限公司，批號：120620)；血管緊張素Ⅱ(A9525，Sigma公司，美國)。

1.3 儀器與試劑

1.3.1 實驗儀器 二氧化碳(CO2)細胞培養箱(Thermo 公司，美國)，超凈工作臺(北京半導體設備一廠，中國)，光學倒置顯微鏡 (型號：Olympus IX70，奧林巴斯，日本)，激光共聚焦[OLYMPUS FLUOVIEW laser scanning confocal microscopes FV1000 Viewer(Ver.1.6)]。

1.3.2 實驗試劑 DMEM 高糖液體培養基(北京邁晨科技公司，中國)，胎牛血清(Gibco，美國)，胰酶，雙抗(Solarbio 中國)，Rhodamine Phalloidin(Lifetechnologies，R-415)。其他試劑均為國產分析純。

1.4 實驗方法

1.4.1 H9C2心肌細胞的培養 根據實際情況，用改良的細胞培養方法培養H9C2心肌細胞[2]。放置在 37 ℃ 5 % CO2培養箱中于含10 % 胎牛血清的高糖液體培養基中進行培養，24 h后更換細胞培養基。當細胞匯合度達 90%以上時，給予傳代培養，一般細胞傳代時間控制在細胞培養后 2 d ～ 3 d。

1.4.2 心肌細胞肥大模型建立及實驗分組 采用AngⅡ誘導心肌細胞肥大模型[3]。AngⅡ溶液[4]：用去離子水配制成10-5mol/L母液，實驗時2 mL的培養基中加入20 μL 10-5mol/L AngⅡ，終濃度達到10-7mol/L，即100 nmol/L，細胞給藥48 h。穩心顆粒溶液：用生理鹽水配制成終濃度為5 g/L，細胞給藥24 h。實驗分3組。Control組：正常H9C2細胞，不加藥物，培養72 h后進行實驗；AngⅡ組：正常H9C2細胞，加AngⅡ培養48 h后再培養24 h；AngⅡ+ WXKL組：正常H9C2細胞，加入AngⅡ48 h 后，再加入WXKL 作用 24 h后進行實驗。

1.4.3 倒置顯微鏡觀察細胞形態 將H9C2細胞種植于35 mm培養皿中，用10-7mol/L的AngⅡ刺激48 h后，再用5 g/L WXKL作用 24 h，在普通光學顯微鏡下觀察細胞形態、大小。

1.4.4 激光共聚焦測細胞骨架蛋白 采用免疫熒光染色法，提前1 d按2.5×105/孔密度接種H9C2細胞到激光共聚焦專用玻底96孔板。待細胞長至70%～80%，用PBS洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，再用PBS沖洗3次，每次5 min。用0.1 % Triton X-100穿透液室溫下穿透細胞5 min，用PBS沖洗3次，每次5 min。用PBS稀釋(2.5 μL)羅丹明鬼筆環肽成200 μL工作液，固定20 min，用PBS沖洗3次，每次5 min，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，分別在各組細胞中隨機選取10 個細胞，測定細胞長度和寬度，取平均值，比較各組細胞的大小。

2 結 果

2.1 穩心顆粒對AngⅡ誘導肥大H9C2細胞形態改善作用 Control組的正常細胞呈長梭形，用10-7mol/L AngⅡ刺激48 h的H9C2心肌細胞形態發生改變，細胞橫向拉伸，腫脹變大，細胞體積較Control組略有增大。而用5 g/L WXKL作用 24 h后，H9C2心肌細胞形態有所恢復，但比Control組細胞橫向寬度增加。詳見圖1。

注：A為正常H9C2細胞；B為H9C2細胞經10-7mol/L AngⅡ 刺激48 h；C為正常H9C2細胞，加入AngⅡ48 h 后，再加入穩心顆粒作用 24 h后進行實驗。

圖1 穩心顆粒對血管緊張素Ⅱ誘導心肌肥厚心肌細胞的影響(×200)

2.2 穩心顆粒對AngⅡ誘導肥大H9C2骨架蛋白的作用(見表1) 在觀察細胞形態發現，Control組的H9C2細胞經10-7mol/L AngⅡ刺激48 h后，細胞形態明顯腫脹變大(見圖2 A)，細胞的長度和寬度增加(P<0.01)(見圖2B和圖2C)。而用5 g/L WXKL作用 24 h后，AngⅡ組的H9C2心肌細胞形態有所恢復，細胞的長度和寬度降低(P<0.05)(圖2D)。

表1 各組細胞長度、寬度比較(±s) μm

注：A為正常H9C2細胞；B為H9C2細胞經10-7mol/L AngⅡ 刺激48 h；C為正常H9C2細胞，加入AngⅡ48 h 后，再加入穩心顆粒作用24 h后進行實驗。

與Control 組比較，**P<0.01；與 AngⅡ組比較，#P<0.05，##P<0.01。

圖2 穩心顆粒衰減細胞肥大

3 討 論

心肌肥厚是心臟為適應各種刺激而產生的心肌細胞蛋白合成增加，肌節數量增多并伴有纖維組織增生。其病理變化包括心肌細胞體積增大、重量增加、直徑增寬或長度增寬，心肌間質細胞增殖以及心臟細胞外基質改變等方面，即心室重構[5]。心肌重構是心臟在內外因素的刺激下，產生的一系列形態學和功能學適應性變化，隨著刺激因素的持續和增強，最終心臟功能失代償而發展成心力衰竭。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)激活是引起心肌重構和心力衰竭的最主要內源性因素之一[6]。從細胞和分子水平看，心肌細胞肥大的過程中，機械信號通過刺激生長因子釋放AngⅡ激活應力感受器，包括：牽拉敏感離子通達、整合素超家族以及細胞骨架將信號傳遞至核內[5]。AngⅡ是RAAS系統的重要組成部分，與心血管事件的發生發展是密不可分的，能夠直接作用于心肌細胞誘導肥大[6-7]。細胞骨架的改變在心肌肥厚和心肌收縮阻力變化方面的作用近年來逐漸受到重視。有研究顯示[8]其本身在心肌細胞肥大、衰竭過程中微管蛋白發生了數量變化，或者穩定性增加，同時細胞黏性系數增加，也說明了細胞骨架改變有可能參與了心肌肥大和心力衰竭的發病過程。心肌細胞的細胞骨架還決定細胞的順應性[9]。馮冰等[10]利用細胞骨架解聚劑觀察了細胞骨架系統在牽張刺激心肌細胞肥大反應中的作用，其理論依據是機械刺激可能通過骨架拉動把力學信息傳遞進入細胞核而引起心肌肥大反應。牟嬌等[11]研究表明細胞骨架是維持細胞結構和正常功能的重要物質基礎，在肥大心肌細胞中的變化可能是細胞在外界致病因素作用下代償性調節的一種表現。由此會影響心肌收縮的阻力，心肌的收縮功能減弱，更容易近一步發展為心力衰竭。同時，細胞骨架作為一種信號傳導通路，能夠接受細胞來自外界的刺激信號。通過檢測肥大心肌細胞骨架蛋白含量及其磷酸化水平，肥大細胞內的主要骨架蛋白成分，包括微管、微絲以及接蛋白等，結果顯示：骨架蛋白表達都會有不同程度的異常增加情況，反而其磷酸化水平表現為明顯降低。心肌肥大的信號轉導機制非常復雜[12]，一般從細胞水平將心肌肥大分為3個環節，即胞外的肥大刺激信號、胞內信號轉導以及核內基因轉錄活化，最終誘導細胞肥大表型變化，如細胞體積增加、收縮蛋白積聚、蛋白合成增加、收縮性蛋白聚合成肌小節單位等。

穩心顆粒作為一個作用于心肌肥厚及治療心律失常的中藥組方，由黨參、黃精、琥珀、三七、甘松等復方組成。具有益氣養陰、活血化瘀、定悸安神、寧心復脈的功效，是抗心律失常的純中藥制劑，能夠抗心律失常，改善心肌供血，降低心肌耗氧量[13]。王國欽等[14]實驗顯示:穩心顆粒具有恢復心肌肥厚的作用，能恢復心肌細胞的形態以及細胞骨架蛋結構，從而可以逆轉心肌肥厚。本研究采用普通光學顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察穩心顆粒對H9C2心肌細胞骨架蛋白的作用。采用熒光免疫法進行熒光染色并觀察，研究顯示：正常H9C2心肌細胞在經過10-7mol/L AngⅡ誘導后，細胞明顯變形，增寬，增長，而在穩心顆粒作用后可以改善由AngⅡ誘導的細胞肥大程度。

對于心肌肥厚，從細胞骨架到信號傳導的轉向愈加受到關注，其中細胞內鈣信號傳遞是誘導心肌肥大的最重要信號轉導通路之一[12]。課題組[15]通過觀察穩心顆粒對細胞內鈣(Ca2+)-鈣調蛋白(CaM)-鈣調蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)信號轉導通路的干預作用，探討其對心肌梗死大鼠模型心律失常的作用機制。研究結果表明：穩心顆粒治療心力衰竭和心律失常的機制可能與其對CaMKⅡ信號轉導通路的調節作用有關。結合本研究中穩心顆粒對細胞骨架蛋白的改善作用，對二者之間的作用途徑，我們將進一步進行實驗，對其進行驗證。

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(本文編輯郭懷印)

The Influence of Wenxin Granule on the Cytoskeleton Protein in Ang Ⅱ Induced H9C2 Cell Hypertrophy Model

Ren Xiaomeng，Chen Yu，Li Jie，Wu Lijun，Yang Xinyu，Wu Aiming，Xing Yanwei，Shang Hongcai，Gao Yonghong

Key Laboratory of Chinese Interna Medicine of Ministry of Education and Beijing，Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China；Guang’anmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing，100053，China

Gao Yonghong (Key Laboratory of Chinese Internal Medicine of Ministry of Education and Beijing，Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China)

Objective To study the effect of Wenxin granule (WXG)on the cytoskeleton protein of angiotensin Ⅱ(AngⅡ)induced H9C2 cell hypertrophy model. Methods H9C2 cells were cultured in vitro，the model of cardiomyocyte hypertrophy was induced by AngⅡ. After dosing WXG with 5 g/L， the morphological changes of the cells and the cytoskeleton were observe. Results The morphological of H9C2 cell induced by AngⅡhad changes，cell transverse tensile，swelling becomes larger，cell volume vs normal cells.After with the addition of WXG，H9C2 myocardial cell morphology had been restored，but still larger than the transverse width of normal cells. And the discovery of cell morphology were observed under confocal laser scanning microscopy (CLSM)，cell morphology was apparent swelling becomes larger，the length and the width of the cell respectively by 120.32 μm±8.36 μm and 51.82 μm±8.62 μm increased to 182.67 μm±7.81 μm and 92.22 μm±7.56 μm. After 24 hours of WXG， H9C2 myocardial cell morphology in AngⅡ group had been restored，the length and the width of the cell to 160.35 μm±5.66 μm，55.87 μm±4.52 μm. Conclusion In H9C2 cell model of hypertrophic myocardium induced by AngⅡ，the WXKL can improve the cytoskeletal protein，which plays a role in improving cardiac hypertrophy.

cardiac hypertrophy；H9C2 cells；angiotensin Ⅱ；Wenxin granule

國家自然基金(No.81373935，81430098)；北京中醫藥大學校級杰青項目(No.2015-JYB-XJQ001)

1.北京中醫藥大學東直門醫院中醫內科學教育部重點實驗室和北京市重點實驗室(北京100700)；2.福建衛生職業技術學院；3.中國中醫科學院廣安門醫院

高永紅，E-mail：gaoyh7088@163.com

R541.4 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.22.006

1672-1349(2016)22-2609-04

2016-08-02)

引用信息：任曉萌，陳鈺，李潔，等.穩心顆粒對AngⅡ誘導H9C2細胞肥大模型骨架蛋白的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2016，14(22)：2609-2612.