黃芪多糖對H2O2所致乳鼠心肌細胞凋亡的影響

沈玉玨

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黃芪多糖對H2O2所致乳鼠心肌細胞凋亡的影響

沈玉玨

目的 研究黃芪多糖(APS)對H2O2所致乳鼠心肌細胞凋亡的影響，并探討其可能的作用機制。方法 分離并培養乳鼠心肌細胞72 h后分為：空白對照組、H2O2組、APS(20 μmol/L、40 μmol/L和80 μmol/L)+H2O2組，每組設10個復孔；給藥干預24 h后，MTT法檢測細胞存活率，通過流式細胞術(Flow Cytometry)檢測細胞凋亡狀況并計算凋亡率；測定細胞中抗氧化酶[超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)]活性和丙二醛(MDA)含量，培養液中心肌酶[谷草轉氨酶(AST)、磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脫氫酶(LDH)]含量，Western blot法檢測細胞中NF-κB、caspase-3蛋白表達并進行半定量分析，RT-PCR法檢測AKT mRNA、bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達并計算bcl-2/Bax表達比值。結果 與H2O2組比較，APS(40 μmol/L、80 μmol/L)+H2O2組細胞存活率顯著升高，細胞凋亡率顯著降低；細胞中SOD、CAT活性顯著升高且MDA含量顯著降低，培養液中AST、CPK、LDH含量顯著降低，細胞中caspase-3、NF-κB蛋白表達量顯著降低，AKT mRNA和bcl-2 mRNA表達顯著上調，Bax mRNA表達顯著下調，bcl-2/Bax表達比值顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。結論 APS可能通過改善抗氧化酶活性、降低氧化應激損傷、降低NF-κB、caspase-3蛋白表達、上調抗凋亡基因表達并下調促凋亡基因表達、提高bcl-2/Bax表達比值，從而對H2O2誘導乳鼠心肌細胞凋亡起抑制作用。

黃芪多糖；心肌細胞；超氧化物歧化酶；過氧化氫酶；心肌酶

目前，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病及其所引發的急性心肌梗死已經逐漸發展成為常見病和多發病，嚴重危害著人們的生命健康和生活質量；臨床上主要采取溶栓、介入支架手術等治療手段及時恢復血流供應，能夠挽救部分心肌梗死病人生命，但“再灌注損傷”并發癥的存在往往嚴重影響著心肌梗死病人預后。缺血再灌注損傷發病機制非常復雜，其中繼發性心肌細胞凋亡是其重要的病理基礎[1-2]。黃芪多糖(Astraglus polysaccharides，APS)是我國傳統中藥黃芪的主要活性成分之一[3]，具有抗氧化、抗凋亡、抗炎、抗腫瘤、增強機體免疫功能等多種藥理學作用[4-8]。本實驗將通過H2O2誘導制備乳鼠心肌細胞損傷模型，研究APS對H2O2所致乳鼠心肌細胞凋亡的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物與試劑 黃芪多糖(西安沃森生物科技有限公司，批號：20131205)； DMEM培養基、胎牛血清(美國Gibco公司)；甲基四唑藍(MTT，美國Sigma公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司)；谷草轉氨酶(AST)、磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)；AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(上海時代生物科技有限公司)；核轉錄因子(NF-κB)、caspase-3單克隆抗體(碧云天生物技術有限公司)；AKT、bcl-2、Bax上下游引物(上海博亞生物公司)。

1.2 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠1 d～3 d乳鼠[9]，購自河北省實驗動物中心，許可證號：SCXK(冀)2008-1-003，動物合格證號：150406007。

1.3 主要儀器 SW-4T-2F潔凈工作臺(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)； NU-4850E型CO2培養箱(美國Nu Aire公司)；VCX750型超聲波細胞破碎儀(美國SONICS公司)；UV762型紫外-可見分光光度計(上海楚定分析儀器有限公司)；BS-300型全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)；iMark型酶標儀、FACS Aria型流式細胞儀(美國BD公司)；DYY-11 型多用電泳儀、JY-SCZ2電泳槽(北京六一儀器廠)；RT-PCR儀(武漢新未來儀器技術有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 乳鼠心肌細胞的分離、培養[9]與分組 細胞的分離：無菌環境下開胸取心臟并剪取心室組織，剪碎、加入0.1%的胰酶后于37 ℃振蕩消化6 min，去上清、沉淀繼續用0.1%胰酶于37 ℃振蕩消化6 min，如此循環直至組織碎塊消化完畢，收集消化上清液，1 500 r/min離心10 min，取沉淀，加入心肌細胞培養基(10%胎牛血清 DMEM，內含105 U/L的青霉素和鏈霉素)，吹打均勻，壁立 1.5 h。收集未貼壁細胞，調整細胞至 6×108個/L，接種于35 mm培養器皿中，37 ℃，5% CO2，100%濕度，培養72 h后，將狀態良好的原代乳鼠心肌細胞隨機分為：空白對照組、H2O2(200 μmol/L)組、APS(20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L)+H2O2(200 μmol/L)組，每組設10個復孔；經藥物干預24 h后，檢測各指標。

1.4.2 細胞存活率的檢測 參照王知斌等[10]報道的實驗方法測定各組細胞存活率：藥物干預24 h后，將細胞接種于96孔培養板(n=6)，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，37 ℃孵育4 h后棄上清，每孔加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)振蕩15 min，通過酶標儀檢測490 nm處OD值，然后計算細胞存活率：

細胞存活率(%)=(實驗組OD值/空白對照組OD值)×100%

1.4.3 細胞凋亡的檢測及細胞凋亡率的計算 藥物干預24 h后，經0.25%的胰酶消化后離心棄上清液，PBS溶液將沖洗2次后，按照AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒操作方法步驟依次進行處理，避光孵育10 min后行Flow Cytometry檢測，觀察各組細胞凋亡狀況并在流式二維圖中計算凋亡率。

1.4.4 細胞中SOD、CAT活性和MDA含量的測定 藥物干預24 h后，棄培養基取細胞，每孔加入2 mL PBS溶液，于冰浴中破碎處理30 s后，低溫離心取上清液，然后通過紫外-可見分光光度計平行測定各組細胞裂解液中SOD、CAT活性和MDA含量。

1.4.5 培養液中AST、CPK、LDH含量的測定 藥物干預24 h后，分別取各組培養液并按照各試劑盒操作方法進行處理，然后通過全自動生化分析儀平行測定各組細胞培養液中AST、CPK、LDH含量。

1.4.6 細胞中NF-κB、caspase-3蛋白表達的檢測 取1.4.3制備的細胞裂解提取液，經12 000 r/min低溫離心10 min后取沉淀，行BCA法蛋白定量，變性后上樣，經電泳、轉膜、春紅溶液染色后，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(NF-κB， caspase-3，β-actin)4 ℃過夜；洗膜，二抗室溫搖床上孵育1 h后經ECL顯色，實驗結果應用Quantity One軟件進行分析。

1.4.7 細胞中AKT mRNA、bcl-2mRNA、Bax mRNA表達的檢測及bcl-2/Bax比值的計算 查閱大鼠AKT、bcl-2、Bax、β-actin基因cDNA序列并通過Oligo軟件設計上、下游引物：AKT：上游5′-TTTATTGGCAGGGAACG-3′，下游5'-AGTCTG AATGGCGGTGGT-3′，擴增片段長度為213bp；bcl-2上游5′-CCTTTGTGTAACT GTACGGCC-3′，5′-CTTTGGCAGTAAATAGCTGATTCGAC-3′，擴增片段長度為317bp；Bax上游5′-GGATGCGTCCACCAAGAA-3′，下游5′-TCCCGGAGGAAGT CCATT-3′，擴增片段長度282 bp；β-actin上游5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAA -3′，下游5′-AAAGAAAGGGAGTAAACCGCA-3′，擴增片段長度432bp。常規消化后收集各組細胞，加入適量TRIzol試劑提取總RNA并測定總RNA濃度，取1 μg RNA反轉錄為cDNA，然后進行PCR反應，擴增完畢后，取PCR產物于瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像儀觀察并照相。以β-actin為內參，由灰度值進行半定量分析AKT mRNA、bcl-2mRNA、Bax mRNA表達，并計算bcl-2/Bax表達比值。

2 結 果

2.1 各組細胞存活率 與空白對照組比較，H2O2組乳鼠心肌細胞存活率顯著降低(P<0.01)；與H2O2組比較，APS(40 μmol/L、80 μmol/L)+H2O2組細胞存活率顯著升高(P<0.01)。詳見表1。

2.2 各組細胞凋亡狀況 空白對照組乳鼠心肌細胞存在極少量凋亡細胞，H2O2組細胞凋亡數量較空白對照組明顯增多；而經APS干預24 h后，能夠顯著改善H2O2誘導損傷乳鼠心肌細胞凋亡狀況，以APS(80 μmol/L)+H2O2組效果最為顯著(見圖1)。計算凋亡率發現：與空白對照組比較，H2O2組細胞凋亡率顯著增高(P<0.01)；而與H2O2組比較，APS(40 μmol/L、80 μmol/L)+H2O2組細胞凋亡率顯著降低(P<0.01)。詳見表1。

注：A為空白對照組；B為H2O2組；C為APS(20 μmol/L)+H2O2組； D為APS(40 μmol/L)+H2O2組；E為APS(80 μmol/L)+H2O2組。圖1 各組細胞凋亡情況表1 各組細胞存活率和凋亡率(±s) %

2.3 各組細胞中SOD、CAT活性和MDA含量 與空白對照組比較，H2O2組乳鼠心肌細胞SOD、CAT活性顯著降低，且MDA含量顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與H2O2組比較，APS(40 μmol/L、80 μmol/L)+H2O2組SOD、CAT活性顯著升高，且MDA含量顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表2。

表2 各組細胞中SOD、CAT活性和MDA含量(±s)

2.4 各組細胞培養液中AST、CPK、LDH含量 與空白對照組比較，H2O2組乳鼠心肌細胞培養液中AST、CPK、LDH含量顯著升高(P<0.01)；與H2O2組比較，APS(40 μmol/L、80 μmol/L)+H2O2組AST、CPK、LDH含量均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。詳見表3。

表3 各組細胞培養液中AST、CPK、LDH含量(±s)

2.5 各組細胞NF-κB、caspase-3蛋白表達 通過Western blot檢測并進行半定量分析發現：與空白對照組比較，H2O2組乳鼠心肌細胞中NF-κB、caspase-3蛋白表達量顯著增高(P<0.01)；與H2O2組比較，APS(40 μmol/L、80 μmol/L)+H2O2組NF-κB、caspase-3蛋白表達量均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。詳見圖2和表4。

注：A為空白對照組；B為H2O2組；C為APS(20 μmol/L)+H2O2組； D為APS(40 μmol/L)+H2O2組；E為APS(80 μmol/L)+H2O2組。圖2 各組細胞凋亡情況表4 各組NF-κB、caspase-3蛋白表達量(±s)

2.6 各組細胞AKT mRNA、bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達及bcl-2/Bax比值 與空白對照組比較，H2O2組細胞AKT mRNA、bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達顯著升高(P<0.05或P<0.01)，bcl-2/Bax比值顯著降低(P<0.01)；與H2O2組比較，APS(40 μmol/L、80 μmol/L)+H2O2組AKT mRNA、bcl-2 mRNA表達顯著升高，而Bax mRNA表達顯著降低(P<0.05或P<0.01)，bcl-2/Bax比值顯著升高(P<0.01)。詳見表5。

表5 各組細胞AKT mRNA、bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達及bcl-2/Bax比值(±s)

3 討 論

細胞凋亡是一種由多種基因參與調控的程序化死亡過程，AKT為抗凋亡基因，在細胞凋亡的啟動及整個過程中發揮著重要的調控作用[11]；Bcl-2家族基因在細胞凋亡過程中也發揮著重要的調控作用，其中bcl-2為抑凋亡基因、Bax為促凋亡基因，二者間相互作用共同調控細胞凋亡過程[12]；并且bcl-2和Bax對細胞凋 亡的調控不僅與二者表達程度有關，可能更依賴于bcl-2/Bax表達比值，bcl-2/Bax比值越低往往凋亡狀況越嚴重[13]；Caspases 蛋白家族參與細胞凋亡啟動以及整個過程的調節，其中caspase-3被認為是各種凋亡刺激因子激活的關鍵蛋白酶[14]。

細胞凋亡具有多種誘發因素，包括氧化應激損傷[15]。NF-κB為多效能核轉錄因子，被稱為連接氧 化應激損傷和細胞凋亡的“橋梁”[16]。生理狀態下，NF-κB以無活性形式存在于胞質中，而當細胞受到ROS攻擊時，NF-κB將被活化并暴露出核定位信號而進入胞核內；Zhang等[17]研究發現：活化NF-κB能夠促進巨噬細胞活化和浸潤，誘導促凋亡信號釋放而導致細胞凋亡，證實NF-κB激活與氧化應激誘導的心肌細胞凋亡密切相關。正常生理狀態下，體內生成的ROS在SOD和CAT的依次催化作用下最終還原生成對人無害的H2O和O2[18-19]，因此SOD、CAT的活性直接反映機體抗氧化能力。此外，血清中脂質過氧化終產物MDA的含量也能夠間接反映細胞損傷程度。正常生理狀態下，血清中心肌酶含量非常低，而當細胞膜受氧自由基攻擊而受損后將導致細胞中心肌酶(AST、CPK、LDH)迅速釋放入血，導致血清中AST、CPK、LDH活性陡然增高，因此血清中三者的活性水平能夠敏感地反映心肌細胞受損程度，它們也是臨床上監測心功能的常用指標。

本實驗研究發現：與空白對照組比較，經APS干預24 h能夠有效提高H2O2誘導損傷乳鼠心肌細胞存活率、降低細胞凋亡率、改善抗氧化酶活性、抑制心肌細胞損傷、上調抗凋亡基因AKT和bcl-2表達、下調促凋亡基因Bax基因表達、提高bcl-2/Bax表達比值、降低caspase-3和NF-κB蛋白表達，提示APS對H2O2所致乳鼠心肌細胞凋亡具有抑制作用，其作用機制可能與APS能夠有效抑制氧化應激損傷以及調節凋亡相關基因和蛋白表達有關。

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(本文編輯郭懷印)

Effects of Astraglus Polysaccharides on the Cadiocytes Apoptosis Induced by H2O2in Neonatal Rat

Shen Yujue

Handan Central Hospital，Handan 056001，Hebei，China

Objective To investigate the effects of astraglus polysaccharides (APS) on the cadiocytes apoptosis induced by H2O2in neonatal rat. Methods Cadiocytes of neonate rat was cultivated for 72 hours and divided into six groups：normal control group，H2O2group，APS (20，40，80 μmol/L) plus H2O2groups(n=10). Twelve hours after the drugs were given，the survival rate was detected by MTT assay.The cardiomyocytes apoptosis was observed by flow cytometry and the apoptosis rate was calculated.The activity of superoxide dismutate(SOD)，catalase (CAT) and the content of malondialdehyde (MDA) in cardiomyocytes were determinted.The content of aspartate aminotransferase(AST)， creatine phosphokinase(CPK)， lactate dehydrogenase (LDH) in culture medium were detected.The expression of nuclear factor-kappa B(NF-κB)，caspase-3 protein was detected by western blot and Semi-quantitative analysized.The expression of AKT mRNA，bcl-2 mRNA，Bax mRNA were detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)and the ratio of bcl-2/Bax was calculated. Results Compared with the H2O2group，the survival rate in APS(40，80 μmol/L) plus H2O2groups was significantly increased.The cardiomyocytes apoptosis was improved and the apoptosis rate was significantly decreased.The activities of SOD，CAT in cardiomyocytes were significantly increased and the content of MDA was significantly decreased.The contents of AST，CPK，LDH in culture medium were significantly decreased.The expression of AKT mRNA，bcl-2 mRNA were significantly up-regulated，while the expression of Bax mRNA was significantly down-regulated，the ratio of bcl-2/Bax was significantly increased.The expression of NF-κB，caspase-3 protein were significantly down-regulated.All of the difference above were significant (P<0.05 or P<0.01). Conclusion APS had inhibitive effects on neonatal rat cadiocytes apoptosis induced by H2O2，which perhaps related to its effects of improving the activity of antioxidase，depressing oxidative stress，down-regulating the expression of NF-κB，caspase-3 protein，up-regulating the expression of anti-apoptotic genes and down- regulating the expression of pro-apoptotic genes，raising the ratio of bcl-2/Bax.

astraglus polysaccharides；H2O2；cardiomyocytes；superoxide dismutate；catalase；myocardial enzymes

河北省邯鄲市中心醫院(河北邯鄲 056001)，E-mail：zhjkhg@163.com

引用信息：沈玉玨.黃芪多糖對H2O2所致乳鼠心肌細胞凋亡的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2016，14(22)：2616-2621.

R329.2 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.22.008

1672-1349(2016)22-2616-06

2016-05-04)