PI3K/AKT/GSK3-b信號轉導通路在紅景天苷保護大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用機制

李 佳

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PI3K/AKT/GSK3-b信號轉導通路在紅景天苷保護大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用機制

李 佳

目的 研究磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶/糖原合酶激酶-3b(PI3K/AKT/GSK3-b)信號傳導通路在紅景天苷保護大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用機制。方法 健康雄性清潔級SD大鼠，結扎大鼠左冠狀動脈前降支，復制心肌缺血再灌注損傷(I/R)模型，隨機分為6組：假手術組(Sham)、心肌缺血-再灌注模型組(I/R)、紅景天苷預防組(紅景天苷+缺血再灌注，S+I/R)、紅景天苷治療組(缺血再灌注+紅景天苷，I/R+S)、紅景天苷預防組+P13K特異性抑制劑LY294002組(S+I/R+LY組)、紅景天苷治療組+P13K特異性抑制劑LY294002組(I/R+S+LY組)，每組6只。采用免疫細胞化學法檢測細胞內絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、AKT磷酸化(p-AKT)、糖原合酶激酶(GSK3-b)、GSK3-b磷酸化(p-GSK3-b)的表達，Western Blot檢測細胞內p-AKT、p-GSK3-b蛋白表達。結果 免疫細胞化學法和Western Blot結果顯示：與 I/R組相比，紅景天苷預防組、治療組大鼠心肌組織中AKT、GSK3-b的磷酸化激活程度顯著升高(P<0.05)，紅景天苷預防組和治療組組間AKT、GSK3-b磷酸化狀態比較，差異無統計學意義(P>0.05)，此變化被PI3K特異性抑制劑LY294002部分阻斷(P<0.05)；I/R組與Sham組相比，AKT、GSK3-b磷酸化蛋白表達略增加，兩組差異無統計學意義(P>0.05)。結論 紅景天苷對大鼠心肌缺血-再灌注損傷具有顯著的保護作用，推測其可能機制主要與激活PI3K/AKT/GSK3-b信號通路等因素有關。

心肌缺血-再灌注損傷；紅景天苷；磷脂酰肌醇-3激酶；絲氨酸；糖原合酶激酶-3b

磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶/糖原合酶激酶-3b(PI3K/AKT/GSK3-b)是細胞內重要的信號轉導通路，在細胞的凋亡、存活以及增殖等活動中發揮重要的生物學功能。2004年Hausenloy等[1]首次提出再灌注損傷激酶(RISK)信號通路，是一組促細胞存活的蛋白激酶，包括PI3K-AKT 和細胞外調節蛋白激酶(Erk)，它們在再灌注的幾分鐘內激活，能夠減輕心肌缺血再灌注損傷(MIRI)，是調節細胞存活的關鍵通路。多種生長因子、癌蛋白和生存因子能引起受體酪氨酸的磷酸化，激活 PI3K 形成磷酸化肌醇磷脂產物PIP3，PIP3作為第二信使將細胞外信號傳遞給PI3K下游的靶蛋白發揮生物學效應，絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(AKT)的磷酸化過程就是其中之一。活化的AKT具有抗心肌缺血缺氧、抗心肌細胞凋亡等作用。繼而使之脫離質膜，進入細胞質和細胞核中，調節糖原合酶激酶(GSK3-b)、p70S6蛋白激酶(p70S6K)、內皮型一氧化氮合酶(eNOS)及抗凋亡因子 Bcl-2 等的表達[2-4]產生心肌保護作用。Wu 等[5]研究發現：舒芬太尼藥物后處理可以縮小心肌梗死面積，同時觀察到藥物后處理組AKT、GSK3-b磷酸化水平增高，PI3K 抑制劑可消除舒芬太尼藥物后處理的心肌保護作用，推測其通過PI3K/AKT/GSK-3b信號通路發揮心臟保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性清潔級SD大鼠，體重240 g±10 g，由南京軍區南京總醫院實驗動物中心提供。全部大鼠分籠標準飼料飼養，自由攝食和飲水，在一定濕度(60%)和室溫(25 ℃)的空間內適應性喂養 1周。

1.2 實驗材料 紅景天苷20 mg：HPLC檢測純度≥98%，南京奧多福尼生物科技有限公司；10%水合氯醛、10%甲醛溶液，0.9%氯化鈉注射液，雙蒸水：南京軍區南京總醫院制劑科提供；AKT抗體：購自美國CST公司(貨號：#4685)；p-AKT抗體：購自美國CST公司(貨號：#2965)；GS3K-b抗體：購自美國CST公司(貨號：#9315)；p-GS3K-b抗體：購自美國CST公司(貨號：#9322)；PI3K抑制劑LY294002：購自美國CST公司(貨號：#9901)；DAB Kit ：中國福州邁新生物科技有限公司DAB-1031；蘇木素染色液：南京建成生物工程研究所D005。

1.3 實驗儀器 HX-100E小動物呼吸機：成都泰盟科技有限公司；12導自動分析心電圖機：北京福田電子醫療儀器有限公司；超低溫保存箱：中國海爾公司BCD-258A/C；數顯恒溫水浴鍋(型號：HH-1)：金壇瑞爾電器有限公司；生物倒置顯微鏡：日本Olympus IX51；Image-Pro Plus 6.0 軟件：美國 Media Cybernetics公司。

1.4 方法

1.4.1 分組方法 雄性清潔級SD大鼠，體重240 g±10 g。將全部大鼠編號，采用數字化隨機分組：假手術組(Sham)、心肌缺血再灌注模型組(I/R)、紅景天苷預防組(紅景天苷+缺血再灌注，S+I/R)、紅景天苷治療組(缺血再灌注+紅景天苷，I/R+S)、紅景天苷預防組+PI3K特異性抑制劑LY294002組(S+I/R+LY組)、紅景天苷治療組+PI3K特異性抑制劑LY294002組(I/R+S+LY組)，每組6只。飼養于恒溫凈化通風動物房，自由進食與飲水。

1.4.2 模型制備方法 大鼠稱重240 g±10 g，按文獻[6]復制模型，以10%水合氯酸(0.32 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠仰臥位固定于鼠板，針狀電極穿刺四肢皮下接心電圖機心電監護，在50 W燈泡頸部照射下，將大鼠舌頭拉出，以防舌根后墜。頸部及左胸備皮，頸前正中縱向剪開大鼠皮膚(長約2 cm)，充分暴露氣管，分離出氣管，于氣管軟骨間隙中橫向切開氣管壁，右手持16G靜脈留置針套管迅速插入，后拔出管芯，氣管插管連接小動物呼吸機，輔助呼吸參數為：呼吸頻率80次/min～100次/min，潮氣量3 mL/kg，呼吸比為5∶2。于大鼠胸骨左緣第3、4助間，距胸骨左緣0.5 cm處依次切開皮膚、淺筋膜、深筋膜，用血管鉗鈍性分離胸大肌及前鋸肌，逐步剪開肋間肌，用自制拉鉤牽開胸廓，注意用棉球保護肺葉以免肺出血，小心打開心包，充分暴露心臟。于肺動脈圓錐和左心耳之間，以左冠狀靜脈主干為標志，用棉簽挑起左心耳，并于其根部下方3 mm～5 mm處進針，使用5/0縫合線，進針深度0.5 mm左右，寬度2 mm左右。并聯合冠脈充氣球囊一同結扎左冠狀動脈前降支(LAD)。清除胸腔內積血，暫時關閉胸腔。假手術組僅在左冠狀動脈穿線不結扎，直接關胸。結扎成功的標志為：心電圖標準導聯上ST段上抬、QRS波出現形似左束支傳導阻滯樣的寬大畸形，左室前壁局部顏色蒼白或發紺。結扎30 min后，松開球囊開始再灌注。冠脈再通的標志為：抬高的ST段下降50%以上，QRS波幅變窄而低，缺血區心肌蒼白或發紺色轉為紅潤。關閉呼吸機，拔出導管，加壓縫合氣管周圍肌肉及皮膚。并將大鼠置于恒溫下待其蘇醒。

1.4.3 給藥方法 紅景天苷預防組和預防組+LY組在造模前連續給藥3 d，1次/日，紅景天苷12 mg/kg腹腔注射；紅景天苷治療組和治療+LY組在再灌注即刻加予紅景天苷12 mg/kg腹腔注射，Sham組和I/R組均給予等量的生理鹽水腹腔注射。紅景天苷預防+LY組和紅景天苷治療+LY組于術前10 min給予腹腔注射磷脂酰肌醇3激酶特異性抑制劑LY294002(溶于DMSO)0.3 mg/(kg·d)。

1.4.4 蛋白表達檢測及磷酸化狀態 采用改良RIPA緩沖液提取心肌組織中蛋白質，BCA比色法測定所提取蛋白的濃度。分離膠12%，濃縮膠5%，按照SDS-PAGE試劑盒說明書配方依次加入制備試劑。將樣品用微量加樣器按一定順序加到孔內。電流20 mA，電壓70 V，130 min，電泳至溴酚藍剛跑出凝膠底部時即可終止電泳。恒壓70 V轉移至PVDF膜。轉膜結束后，取出膜放入培養皿中，加封閉液，37 ℃溫育1.5 h。封閉結束后取出膜TBST洗3次×5 min，用封閉液按比例稀釋一抗(1∶1 000)后敷一抗，4 ℃過夜。將膜取出封閉液3次×5 min，TBST洗3次×5 min，濾紙吸干，PBS稀釋二抗(1∶2 500)，37 ℃溫育1 h。封閉液3次×5 min，TBST洗3次×5 min，濾紙吸干，應用顯影定影法顯像。

2 結 果

2.1 完成實驗情況 本實驗共用大鼠44只，預實驗8只，在制備模型過程中，有4只大鼠因建模失敗剔除(氣管插管失敗1只，結扎后即刻出現室顫死亡1只，缺血期間發生無法糾正的惡性心律失常死亡1只，拔出氣管插管后死亡1只)。

2.2 心肌組織AKT磷酸化狀態 Sham組大鼠心肌組織AKT的磷酸化水平很低，I/R組與Sham組相比，AKT磷酸化(pAKT)蛋白表達略增加，這可能是大鼠自身的保護性反饋作用，兩組差異無統計學意義。缺血再灌注后，與 I/R組(p-AKT/AKT 0.56±0.09)相比，紅景天苷預防組(p-AKT/AKT0.86±0.12)、治療組(p-AKT/AKT 0.73±0.11)大鼠心肌組織中AKT的磷酸化激活程度顯著升高。紅景天苷預防組和紅景天苷治療組間AKT磷酸化狀態比較，差異無統計學意義(P>0.05)。而這種激活程度的上升可以被PI3K特異性抑制劑LY294002阻斷，表現為紅景天苷預防+LY組(p-AKT/AKT 0.27±0.07)、紅景天苷治療+LY組(p-AKT/AKT 0.36±0.11)AKT磷酸化水平顯著降低(P<0.05)。詳見圖1、圖2。

圖1 各組梗死區心肌組織 AKT蛋白表達的代表性條帶

注：與手術組比較，*P<0.05；與預防組+LY比較，

#P<0.05；與治療組+LY比較，∧P<0.05。

圖2 各組梗死區心肌組織 AKT蛋白表達

2.3 各組心肌組織GSK3-b磷酸化狀態 Sham組大鼠心肌組織GSK3-b的磷酸化水平很低，I/R組與Sham組相比，GSK3-b磷酸化(p-GSK3-b)蛋白表達略增加，這可能是大鼠自身的保護性反饋作用，兩組 差異無統計學意義；缺血再灌注后，與 I/R組(p-GSK3-b/GSK3-b 0.47±0.07)相比，紅景天苷預 防組(p-GSK3-b/GSK3-b 0.97±0.07)、治療組(p-GSK3-b/GSK3-b 0.91±0.13)大鼠心肌組織中GSK3-b 的磷酸化激活程度顯著升高。紅景天苷預防組和紅景天苷治療組比較，GSK3-b磷酸化水平差異無統計學意義(P>0.05)。應用PI3K抑制劑LY294002后，紅景天苷對GSK3-b的激活明顯被抑制，表現為紅景天苷預防+LY組(p-GSK3-b/GSK3-b 0.21±0.07)、紅景天苷治療+LY組(p-GSK3-b/GSK3-b 0.30±0.05)GSK3-b磷酸化水平顯著降低(P<0.05)。詳見圖3、圖4。

圖3 各組梗死區心肌組織 GSK3-b蛋白表達的代表性條帶

注：與手術組比較，*P<0.05；與預防組+LY比較，#P<0.05；與治療組+LY比較，∧P<0.05。

圖4 各組梗死區心肌組織 GSK3-b蛋白表達

3 討 論

PI3K/AKT/GSK3-b信號通路是經典的再灌注損傷挽救激酶信號通路(RISK)之一，具有很多保護性的調控作用，如調節糖原合成、減少細胞凋亡、調控葡萄

糖的轉運等。Tisser等研究發現，植物雌激素藥物能夠減輕兔心肌缺血再灌注損傷，且可以觀察到AKT磷酸化增加{6]。隨著研究的不斷深入，大量實驗研究報道很多藥物可以通過激活RISK進而發揮心肌保護作用。RISK信號通路的激活主要表現為相關靶點的磷酸化，如PI3K，AKT和GSK3-b的磷酸化。本實驗結果顯示：紅景天苷預處理、后處理可激活 RISK 通路，使AKT、GSK3-b磷酸化狀態增多，發揮心肌保護作用。同時，預處理、后處理在AKT、GSK3-b磷酸化水平上無顯著差異，表明二者激活 RISK 通路作用類似，均是有效減輕MIRI的途徑。為了進一步證明紅景天苷經 PI3K/AKT/GSK3-b通路發揮作用，選擇了PI3K的特異性抑制劑 LY294002進行實驗。結果顯示治療+LY 組和紅景天苷預防+LY組的AKT、GSK3-b磷酸化水平較紅景天苷預防組和治療組顯著降低，且與I/R組比較埋頭差異無統計學意義，表明PI3K信號通路被抑制，AKT、GSK3-b的磷酸化受限，紅景天苷的心肌保護作用消失。

綜上所述，紅景天苷對大鼠心肌缺血-再灌注損傷具有顯著的保護作用，由研究結果推測，其可能的作用機制與增加GSK3-b、AKT磷酸化蛋白表達，激活PI3K/AKT/GSK3-b信號通路等因素有關。當然本研究仍存在不足，如時間關系及實驗條件限制，僅對紅景天苷抗MIRI的分子生物學機制做了初步探討，希望從PI3K/AKT/GSK3-b信號轉導通路的上游及下游的相關通路入手，進行更深入的研究，為臨床應用提供更豐富的理論依據。

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(本文編輯郭懷印)

江蘇省常州市德安醫院(江蘇常州 213000)，E-mail：609234006@qq.com

引用信息：李佳.PI3K/AKT/GSK3-b信號轉導通路在紅景天苷保護大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用機制[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2016，14(22)：2621-2624.

R542.2 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.22.009

1672-1349(2016)22-2621-04

2016-03-21)