淫羊藿苷對阿爾茨海默病大鼠模型COX-2表達(dá)的影響

甄 瑾，王梅玲，朱潤秀，肖 梅，傅永旺，郭建雄

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淫羊藿苷對阿爾茨海默病大鼠模型COX-2表達(dá)的影響

甄 瑾，王梅玲，朱潤秀，肖 梅，傅永旺，郭建雄

目的 觀察淫羊藿苷(ICA)對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的阿爾茨海默病(AD)炎癥模型大鼠海馬內(nèi)環(huán)氧酶-2(COX2)表達(dá)的影響。方法 將36只Wistar大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、ICA低劑量組[ICA30 mg/(kg·d)]、ICA高劑量組[ICA120 mg/(kg·d)]，側(cè)腦室注射脂多糖建立AD炎癥模型(對照組注射生理鹽水)，連續(xù)灌胃2周，每天1次，斷頭取腦，免疫組化法(SP法)檢測大鼠海馬內(nèi)COX-2蛋白的表達(dá)，用圖像分析系統(tǒng)對染色結(jié)果進(jìn)行分析；通過SYBR GREENⅠ熒光定量PCR檢 測大鼠海馬內(nèi)COX-2 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果 與模型組相比，高劑量組COX-2蛋白及mRNA的表達(dá)明顯降低(P<0.01)，但仍明顯高于對照組(P<0.01)，低劑量組COX-2蛋白及mRNA的表達(dá)與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 高劑量淫羊藿苷可降低AD炎癥模型大鼠海馬內(nèi)COX-2的表達(dá)，可抑制炎癥反應(yīng)對神經(jīng)細(xì)胞的損傷。

阿爾茨海默病；淫羊藿苷；內(nèi)環(huán)氧酶-2；脂多糖

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種常見的老年神經(jīng)變性疾病，臨床上表現(xiàn)為隱匿起病、緩慢進(jìn)展、逐漸加重的癡呆和精神行為異常，是癡呆的最常見原因。隨著世界人口老齡化，癡呆已成為老年人群中繼心血管病、癌癥、中風(fēng)之后的第四大“殺手”，為家庭和社會帶來嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。AD的病因和發(fā)病機(jī)制尚未明了，目前認(rèn)為是遺傳、環(huán)境等多因素致病的復(fù)雜病理過程。證據(jù)顯示炎癥反應(yīng)機(jī)制在AD的發(fā)病和進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。流行病學(xué)研究結(jié)果顯示：長期服用非甾體抗炎藥可以明顯降低AD的發(fā)病率，并嘗試用抗炎藥物治療AD。治療AD的中醫(yī)方劑中淫羊藿占有重要地位，淫羊藿提取物淫羊藿苷(Icariin，ICA)具有抗炎作用。本實驗旨在觀察ICA治療后的AD炎癥模型大鼠海馬內(nèi)環(huán)氧酶合-2(COX-2)的表達(dá)，并探討ICA對AD模型的作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 RM八臂迷宮分析測試系統(tǒng)，JD801圖像分析系統(tǒng)，7300實時熒光PCR儀，S-P試劑盒，DAB顯色液，抗COX-2多克隆抗體濃縮型，反轉(zhuǎn)錄酶，COX-2引物，GAPHD引物，淫羊藿苷，脂多糖。

1.2 實驗動物 健康普通成年雄性Wistar大鼠36只，體重200 g～260 g，購自內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物中心，均為清潔級動物，分組分籠飼養(yǎng)，充分光照，每12 h明暗交替，控制室溫18 ℃～21 ℃，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)水，在進(jìn)行八臂迷宮實驗前限制大鼠飲食，使其體重維持在自由進(jìn)食體重的80%～85%。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組及AD模型制備 八臂迷宮訓(xùn)練成功[1]的Wistar大鼠36只隨機(jī)分為4組，分別為對照組、模型組、低劑量組[ICA30 mg/(kg·d)]、高劑量組[ICA120 mg/(kg·d)]，每組Wistar大鼠9只。大鼠八臂迷宮訓(xùn)練成功后次日通過側(cè)腦室注射5 μg/μL LPS溶液10 μL誘導(dǎo)AD炎癥模型。定位參照George Paxinos[2]的《大鼠腦立體定位圖譜》。造模后次日八臂迷宮實驗觀察大鼠的空間記憶能力以判定模型的成敗[1]。

1.3.2 給藥方法及取材 大鼠側(cè)腦室注射后次日起，連續(xù)相應(yīng)灌胃14 d，每天1次，對照組和模型組給予蒸餾水灌胃，低劑量組給予ICA30 mg/(kg·d)灌胃，高劑量組給予ICA120 mg/(kg·d)灌胃。八臂迷宮測試完成后24 h內(nèi)2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40 mg/kg～50 mg/kg)。斷頭取腦，一側(cè)大腦立即放入液氮保存，用于RT-PCR 定量檢測；另一側(cè)多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片。

1.3.3 免疫組織化學(xué)法 參照津脈公司提供的免疫組化試劑盒檢測步驟進(jìn)行免疫組化S-P法染色檢測COX-2的表達(dá)。COX-2蛋白均定位于胞漿，細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)觀察5個高倍視野，利用生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對圖像進(jìn)行分析，測定灰度值。

1.3.4 RT-PCR檢測 提取RNA并反轉(zhuǎn)錄，應(yīng)用SYBR GREENⅠ熒光定量PCR檢測AD模型大鼠大腦海馬組織內(nèi)COX-2mRNA表達(dá)，具體方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)果分析處理用相對定量方法測定。基因表達(dá)量=2-△CT，用△CT法計算干擾結(jié)果，公式為：△CT未知樣品=CT未知樣品-CT內(nèi)參，內(nèi)參為大鼠持家基因GAPDHmRNA。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠海馬內(nèi)免疫組化COX-2的表達(dá) 免疫組化染色顯示各組海馬內(nèi)均有COX-2的表達(dá)。與 模型組比較，高劑量組COX-2表達(dá)明顯減少(P<0.01)，但仍明顯高于對照組(P<0.01)；低劑量組 COX-2的表達(dá)與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

2.2 各組大鼠海馬內(nèi)COX-2mRNA的表達(dá) 與模型 組比較，高劑量組COX-2mRNA的表達(dá)明顯減少(P<0.01)，但仍明顯高于空白對照組(P<0.01)；低劑量組COX-2mRNA的表達(dá)與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 COX-2在各組大鼠海馬內(nèi)的表達(dá)(±s)

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)AD腦組織中炎癥反應(yīng)標(biāo)志物有增高趨勢，腦組織的淀粉樣斑塊中有多種補體因子及抑制因子。AD病人腦內(nèi)的β淀粉樣蛋白(Aβ)可激活小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，并通過炎癥介質(zhì)如IL-1、IL-6、COX-2等引起神經(jīng)元的損害。花生四烯酸(arachidonic acid，AA)代謝通路是炎癥的核心網(wǎng)絡(luò)，環(huán)氧合酶(cyclooxygenases，COXs)是 AA 代謝途徑中的關(guān)鍵酶，會導(dǎo)致一系列炎癥因子的產(chǎn)生，在AD發(fā)病機(jī)制中起重要作用[3]。在AD的非常早期階段，當(dāng)β淀粉樣蛋白只有少量沉積，皮質(zhì)區(qū)極少量神經(jīng)纖維纏結(jié)的時候，神經(jīng)元內(nèi)COX-2表達(dá)即增多，其表達(dá)水平與炎癥的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[4]。 COX-2是核因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶目標(biāo)之一，證據(jù)表明核因子κB(NF-κB)、COX-2與AD的炎性反應(yīng)過程關(guān)系密切，COX-2及其產(chǎn)生的NF-κB信號通路參與神經(jīng)元的死亡機(jī)制[5-6]。長期服用抑COX的非甾體抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)可明顯降低AD發(fā)病相對危險系數(shù)[7]，但嚴(yán)重的胃腸道毒副作用限制了傳統(tǒng) NSAIDs在AD病人中的應(yīng)用。Heneka等[8]的研究證實非甾體類抗炎藥物布洛芬能減少轉(zhuǎn)基因小鼠MG和星型膠質(zhì)細(xì)胞的活化數(shù)量，降低COX-2的產(chǎn)生而減輕大腦組織的氧化損傷。抑制活化的COX-2可能通過抑制炎癥反應(yīng)和自由基損傷，進(jìn)而改善老年性癡呆的認(rèn)知能力障礙。本研究結(jié)果顯示，AD炎癥模型給予高劑量ICA治療后COX-2表達(dá)明顯減少，表明ICA可抑制中樞炎癥反應(yīng)、抑制膠質(zhì)細(xì)胞的活化與增殖進(jìn)而改善AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

[1] 甄瑾，李潤今，王梅玲.淫羊藿苷對阿爾茨海默病炎癥模型大鼠記憶能力及其海馬內(nèi)GFAP，TNF-α，IL-6表達(dá)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管雜志，2013，11(2):192-194.

[2] George Paxinos，Charles Wharles Watson.The rat brain in stereotaxic coordinates [M].諸葛啟，譯.第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005：6.

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[7] Imbimbo BP， Solfrizzi V， Panza F.Are NSAIDs useful to treat Alzheimer’s disease or mild cognitive impairment? [J].Front Aging Neurosci，2010，2：1.

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(本文編輯郭懷印)

The Influence of Icariin on the Expression of COX-2 in Rats with Alzheimer-like Model

Zhen Jin，Wang Meiling，Zhu Runxiu，Xiao Mei，F(xiàn)u Yongwang，Guo Jianxiong

Inner Mongolian People’s Hospital，Huhhot 010017， Inner Mongolia，China

Objective To investigate the influence of icariin (ICA)on the expression of cyclooxygramse 2 (COX-2)in inflammational rat model hippocampus with Alzheimer’s disease(AD) induced by lipopolysaccharides(LPS). Methods Thirty-six rats were allocated into 4 groups:control group，model group，low-dose ICA group and high-dose ICA group.The rat models of AD were induced by being injected LPS into the lateral cerebral ventricle. After two weeks of intragastric administration，brain tissue of rats was removed. The expressions of COX-2 protein and mRNA in hippocampus of the rats were detected by immunohistochemistry(SP method)and SYBR GREEN fluorescence quantitative RT-PCR. Results The expressions of COX-2 protein and mRNA in high-dose ICA group were significantly lower than those in model group (P<0.01). Conclusion The high-dose ICA can reduce the expression of COX-2 in inflammational rat model hippocampus of AD and can inhibit the inflammatory reaction of nerve cells injury.

Alzheimer’s disease;icariin；cyclooxygramse 2；lipopolysaccharides

內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金(No.200711020933)

內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院(呼和浩特 010017)，E-mail:zhenjin2006106@126.com

引用信息：甄瑾，王梅玲，朱潤秀，等.淫羊藿苷對阿爾茨海默病大鼠模型COX-2表達(dá)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2016，14(22)：2629-2630.

R743 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.22.012

1672-1349(2016)22-2629-02

2016-05-02)