藤珠胃康顆粒含藥血清對小鼠胃癌MFC細胞增殖和凋亡的影響

王金，王芳，王小平，白吉慶

(陜西中醫藥大學 藥學院，陜西 咸陽 712046)

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藥理學

藤珠胃康顆粒含藥血清對小鼠胃癌MFC細胞增殖和凋亡的影響

王金，王芳，王小平，白吉慶

(陜西中醫藥大學 藥學院，陜西 咸陽 712046)

目的 研究藤珠胃康顆粒含藥血清對小鼠胃癌MFC細胞增殖和凋亡的影響。方法 MFC細胞經不同濃度藤珠胃康顆粒含藥血清處理后，采用MTT法檢測藤珠胃康顆粒含藥血清對細胞增殖的影響；采用倒置顯微鏡觀察細胞形態變化；采用流式細胞儀及AnnexinV/PI染色的方法檢測對細胞凋亡的影響。結果 與對照組比較，藤珠胃康顆粒含藥血清中、高劑量組細胞增殖抑制率顯著增高(P<0.05)；顯微鏡下觀察，貼壁細胞逐漸脫落、縮成圓形；與對照組比較，給藥組細胞凋亡率均顯著增高(P<0.05)，并呈現劑量依賴性。結論 藤珠胃康顆粒含藥血清對小鼠胃癌MFC細胞增殖有抑制作用，并能誘導細胞凋亡。

藤珠胃康顆粒； 胃癌； MFC細胞； 增殖； 細胞凋亡

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，根據2015年全國腫瘤登記中心統計的數據顯示，2012年胃癌發病率、死亡率分別位居我國惡性腫瘤的第2位、第3位[1]。早期胃癌治療通常以手術為主，中晚期則以放療、化療、生物治療及中醫藥治療為主[2]，近年來研究發現，中醫藥治療可以明顯緩解臨床癥狀、減輕放化療毒副反應，提高生存質量[3]。藤珠胃康顆粒是從陜西省中老名醫沈舒文教授臨床常用方劑中篩選出來的，由藤梨根、珠子參、黃精、白術、三棱等五味藥材組成，具有解毒抗癌、益氣養陰之功效，臨床應用多年，效果良好。為了進一步探討其抗癌機制，本文采用MTT法和AnnexinV/PI雙染法觀察藤珠胃康顆粒含藥血清對小鼠胃癌MFC細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料

1.1 動物

SPF級SD雄性大鼠20只，體質量180～210 g，西安交通大學醫學部實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK (陜)2012-003。

1.2 MFC細胞株

購自武漢博士德生物工程有限公司，批號：CX0211。

1.3 藥物與試劑

藤珠胃康顆粒由實驗室自制；RPMI-1640、標準胎牛血清、PBS漂洗液、AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、二甲基亞砜(DMSO)均購自武漢博士德生物工程有限公司；0.25%胰蛋白酶消化液、青鏈霉素混合液均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.4 主要儀器

CCL-170B-8型CO2培養箱(新加坡ESCO)、BDS200倒置顯微鏡(重慶奧特光學儀器有限責任公司)、Elx808酶標儀(美國BioTek)、FC500流式細胞儀(美國 BeckMan)、KDC-40低速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)、CR22GⅡ高速冷凍離心機(日本日立)。

2 方法

2.1 藤珠胃康顆粒的制備

將藤梨根、三棱、黃精、白術四味藥加10倍量水煎煮3次，每次1 h，濾過，合并煎液，減壓濃縮成稠膏，減壓干燥制成干膏粉備用；將珠子參10倍量50%(φ)乙醇提取1次，2 h，濾過，回收乙醇，濃縮成稠膏，減壓干燥制成干膏粉備用。上述兩種干粉，加入糊精和乳糖適量，混勻，用80%(φ)乙醇作潤濕劑，濕法制粒，60 ℃干燥，即得。

2.2 含藥血清的制備

將SD大鼠隨機分為對照組(等量純化水)、藤珠胃康顆粒低(4.3 g/kg)、中(8.6 g/kg)、高(17.2 g/kg)劑量組(以生藥計)，分別相當于臨床每日劑量的5倍、10倍、20倍。每日灌胃1次，連續6 d，于第6天灌胃1 h后，腹主動脈采血，3 000 r/min離心10 min，分離血清，56 ℃滅活30 min，0.22 μm無菌濾膜過濾后分裝，置-20 ℃冰箱保存備用。

2.3 MTT法測定含藥血清對MFC細胞增殖的影響

收集對數生長期的細胞，調整細胞密度為3×104個/mL，以100 μL/孔接種于96孔板中，在37 ℃、5%(φ)CO2培養箱中培養24 h后，吸棄原培養液，每孔加入100 μL 含10%藤珠胃康顆粒含藥血清的RPMI-1640培養液，每組設5個復孔，同時設置對照孔。繼續培養24 h后，吸棄原培養液，每孔加入100 μL 含10% MTT的RPMI-1640培養液，繼續培養4 h后，吸棄孔中液體，每孔加入100 μL DMSO，輕微震蕩使結晶全部溶解后，于酶標儀570 nm波長處測定A值，計算抑制率，結果重復3次。腫瘤細胞抑制率(%)=(1-實驗組A/對照組A)。

2.4 形態學觀察

收集對數生長期的細胞，調整細胞密度為5×105個/mL，以1 mL/孔接種到6孔板，于37 ℃、5%CO2的環境中培養24 h后，消化，離心，加入不同濃度的含藥血清，培養24 h，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。

2.5 流式細胞檢測細胞凋亡

收集不同濃度含藥血清處理24 h的對數生長期的MFC細胞，調整細胞密度為5×105個/mL，取1 mL細胞懸液置1.5 mL無菌離心管中，1 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清液，加入1 mL預冷的PBS，輕輕震蕩使細胞懸浮，1 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清液，重復此步驟2次，將細胞重懸于200 μL Binding Buffer中，加入10 μL AnnexinV-FITC和10 μL PI(碘化丙錠)溶液，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，然后加入300 μL Binding Buffer，轉入流式管上用流式細胞儀分析。

2.6 統計學處理

3 結果

3.1 藤珠胃康顆粒含藥血清對MFC細胞增殖的影響

藤珠胃康顆粒含藥血清作用于細胞24 h后，對MFC細胞的抑制作用隨含藥血清濃度的增加而增強。與對照組比較，低劑量組差異無統計學意義(P>0.05)；中、高劑量組與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 藤珠胃康顆粒含藥血清對MFC細胞增殖的影響

組別劑量/(g·kg-1)A值細胞增殖抑制率/%對照組-0.148±0.02-藤珠胃康顆粒 低劑量組4.30.116±0.0121.62±0.07 中劑量組8.60.106±0.0228.38±0.14* 高劑量組17.20.098±0.0133.78±0.07*

與對照組比較：*P<0.05。

3.2 形態學觀察結果

對照組細胞培養24 h后，細胞生長旺盛，延展性較好，移動和增殖符合MFC胃癌細胞規律，呈現細胞堆積狀態；隨著含藥血清濃度增加，細胞慢慢縮成圓形，成單個獨立個體，生長慢慢趨于遲緩，說明藤珠胃康顆粒對MFC小鼠胃癌細胞生長有一定的抑制作用。見圖1。

3.3 流式細胞儀測定細胞凋亡結果

藤珠胃康顆粒含藥血清作用于細胞24 h后，與對照組(23.3%)比較，隨著含藥血清濃度的升高，細胞凋亡率顯著增高(36.3%、45.4%、65.5%，P<0.05)，初步說明藤珠胃康顆粒含藥血清可能會誘導小鼠胃癌MFC細胞發生凋亡。見圖2。

A.空白對照組； B.藤珠胃康顆粒低劑量組； C.中劑量組；D.高劑量組。

圖1 藤珠胃康顆粒含藥血清對MFC細胞形態的影響(200×)

Figure 1 Effect of serum containing Tengzhu Weikang Granule on the morphology of MFC cells (200×)

Annexin V

A.空白對照組； B.藤珠胃康顆粒低劑量組； C.中劑量組； D.高劑量組。

圖2 藤珠胃康顆粒含藥血清對MFC細胞凋亡的影響

Figure 2 Effect of serum containing Tengzhu Weikang Granule on the apoptosis of MFC cells

4 討論

腫瘤發生的實質是細胞周期調控的紊亂導致機體細胞無間斷的進入細胞周期，失去自主凋亡能力、惡性增殖的結果。因此抑制腫瘤細胞增殖，并誘導細胞凋亡是治療腫瘤的重要手段[4-5]。

MTT實驗結果顯示，藤珠胃康顆粒含藥血清可以抑制胃癌細胞的增殖，與對照組比較，低劑量組吸光度值差異無統計學意義，含藥血清對細胞的抑制作用不明顯；中劑量組吸光度值顯著降低，含藥血清對細胞產生了抑制作用；高劑量組抑制作用明顯增強，說明藤珠胃康顆粒含藥血清對MFC細胞的抑制作用存在一定的濃度依賴性。由于在顯微鏡下觀察，貼壁細胞逐漸脫落、縮成圓形，提示細胞可能發生了凋亡。進一步采用流式細胞儀檢測細胞凋亡，結果顯示給藥組細胞凋亡率高于對照組，且隨著含藥血清濃度的升高，細胞凋亡率逐漸增高，提示藤珠胃康顆粒含藥血清具有誘導細胞凋亡的作用。說明藤珠胃康顆粒含藥血清可以通過誘導細胞凋亡的方式來達到減緩細胞增殖的目的，但對于其抑制細胞增殖是否有其他作用機制，則有待于進一步的研究。

凋亡是多基因參與調控、多種蛋白相互作用的極其復雜的過程[6]。目前調控腫瘤細胞凋亡的主要基因有Bcl-2基因家族、c-myc基因、p53基因、caspase家族等[7-8]。藤梨根作為方中君藥，發揮主要抗腫瘤作用，近年來對其作用機制研究很多。申力等[9]研究發現，獼猴桃根多糖可通過下調Mcl-1、Bcl-2、Bcl-x1蛋白和上調Bax、Bak蛋白的表達誘導MFC細胞凋亡。宋文瑛等[10]發現，獼猴桃根多糖可通過激活p38途徑，進而激活caspase-9和PARP，最終誘導SGC-7901細胞凋亡。白吉慶等[11]研究發現藤梨根提取物可抑制Bcl-2蛋白表達而促進SGC-7901細胞凋亡。本研究結果表明，藤珠胃康顆粒含藥血清可以誘導MFC細胞凋亡，推測其可能是通過上述一個或多個作用途徑聯合完成的，但對于其具體的作用機制，還需進一步的深入研究。

[1] 陳萬青，鄭榮壽，張思維，等. 2012年中國惡性腫瘤發病和死亡分析[J].中國腫瘤，2016，25(1):1-8.

[2] 吳頡，葛信國.中晚期胃癌中醫治療進展[J].遼寧中醫藥大學學報，2013，15(1):214-216.

[3] 李鑫，衛蓉.中醫中藥治療胃癌的研究進展[J].貴陽中醫學院學報，2012，34(1):116-119.

[4] 尤琪，張卉寧，黎昆東，等.雙氫青蒿素促胃癌細胞凋亡的作用[J].廣東藥學院學報,2016,31(4):1-4.

[5] 韋麗蘭,莫書榮.紅景天苷對人胃癌細胞SGC-7901抑瘤作用的體外實驗研究[J].山東大學學報(醫學版),2015,53(12):12-15.

[6] 李娜,高俊巖,劉敏.細胞凋亡和腫瘤的關系研究進展[J].當代醫學,2009,15(16):13-14.

[7] 劉延祥,張學武. 中藥誘導腫瘤細胞凋亡的研究進展[J]. 時珍國醫國藥,2007,18(7):1563-1565.

[8] 何莉莎,李枋霏,孫桂芝,等.中藥誘導腫瘤細胞凋亡的實驗研究進展[J].河北中醫,2014,36(2):309-312.

[9] 申力,張光霽,張廣順,等.獼猴桃多糖對前胃癌MFC細胞及其原位移植瘤細胞凋亡的影響[J].中草藥,2014,45(5):673-678.

[10] 宋文瑛,許冠華,張光霽.獼猴桃根多糖對人胃癌SGC-7901細胞增殖、凋亡及p-p38表達的影響[J].中國中西醫結合雜志,2014,34(3):329-333.

[11] 白吉慶,王小平,葉崢嶸.藤梨根提取物對人胃癌SGC-7901細胞凋亡及Bcl-2的影響[J].陜西中醫學院學報,2012,35(1):59-61.

(責任編輯：幸建華)

Effect of serum containing Tengzhu Weikang Granule on the proliferation and apoptosis of murine gastric cancer MFC cells

WANG Jin,WANG Fang,WANG Xiaoping,BAI Jiqing

(ShaanxiUniversityofChineseMedicine,Xianyang712046,China)

Objective To study the effect of serum containing Tengzhu Weikang Granule on the proliferation and apoptosis of murine gastric cancer MFC cells. Methods MFC cells were treated with serum containing Tengzhu Weikang Granule at different concentrations. The proliferation of MFC cells was determined by MTT assay. Morphological changes of cells were observed by inverted microscope. The cell apoptosis was detected by flow cytometry and AnnexinV/PI. Results Compared with the control group,the inhibition rate of cell proliferation was obviously increased in the middle and high dose groups (P<0.05). MFC cells turned round and gradually fell off. Meantime,the apoptosis rate of MFC cells was significantly higher in drug-treated groups in a dose-dependent manner (P<0.05). Conclusion Serum containing Tengzhu Weikang Granule can efficiently inhibits MFC cell proliferation and induces cell apoptosis.

Tengzhu Weikang Granule; gastric cancer; MFC cells; proliferation; apoptosis

2016-07-30

陜西省科技統籌創新工程計劃項目(2012KTCL03-14)

王金(1990—)，女，2014級碩士研究生，研究方向為中藥質量評價及新藥開發，Email: 1324511646@qq.com；通信作者：王小平(1976—)，女，博士后，教授，碩士生導師，主要從事中藥質量評價及新藥開發，Email: wangxiaoping323@126.com。

時間：2016-11-29 11:06

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161129.1106.007.html

R965

A

1006-8783(2016)06-0733-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016073001