羥基紅花黃色素A與芍藥苷聯合用藥對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用

秦莎莎，余夢黎，廖金明，徐愉林，鄭麗嫻，朱原，李蕾，姚暉，張繼平，韓彬

(1.廣東藥科大學 中藥學院，廣東 廣州 510006； 2.廣東醫科大學 藥學院，廣東 湛江 524023； 3.南方醫科大學 中醫藥學院，廣東 廣州 510515； 4.南方醫科大學 附屬佛山醫院，廣東 佛山 528000)

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羥基紅花黃色素A與芍藥苷聯合用藥對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用

秦莎莎1，余夢黎2，廖金明3，徐愉林2，鄭麗嫻3，朱原3，李蕾1，姚暉4，張繼平4，韓彬1

(1.廣東藥科大學 中藥學院，廣東 廣州 510006； 2.廣東醫科大學 藥學院，廣東 湛江 524023； 3.南方醫科大學 中醫藥學院，廣東 廣州 510515； 4.南方醫科大學 附屬佛山醫院，廣東 佛山 528000)

目的 研究羥基紅花黃色素A(HSYA)與芍藥苷聯合用藥對急性局灶性腦缺血再灌注(I/R)損傷大鼠的協同保護作用，并探討其作用機制。方法 110只雄性SD大鼠，隨機分為6組：HSYA組(5.0 mg/kg)、芍藥苷組(5.0 mg/kg)、HSYA與芍藥苷聯合用藥組(合用組,各5.0 mg/kg)、銀杏內酯組(5 mg/kg)、模型組和假手術組。采用改良線栓法復制大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)再灌注模型。腦缺血1 h再灌注6 h后進行神經功能缺失評分及尾靜脈注射給藥；給藥7 d后進行神經功能缺失評分；氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法檢測腦梗死面積；免疫組化(IHC)法檢測磷酸化Akt1蛋白的表達量的變化情況。結果 與假手術組比較，模型組大鼠治療前評分明顯高于假手術組，差異具有統計學意義(P<0.01)，說明造模成功；與模型組比較，銀杏內酯組、合用組、芍藥苷組和HSYA組能不同程度地抑制大鼠體質量下降(P<0.05，P<0.01)，改善腦缺血再灌注大鼠的神經功能缺失癥狀(P<0.05，P<0.01)，降低皮質區神經細胞的損傷程度，減小腦梗死面積(P<0.05，P<0.01)，促進磷酸化Akt1蛋白的表達(P<0.01)；HSYA組、芍藥苷組、銀杏內酯組磷酸化Akt1蛋白的表達較合用組低(P<0.01)。結論 HSYA與芍藥苷聯合用藥對腦缺血再灌注大鼠的腦損傷具有一定的協同保護作用，二者聯合用藥的作用優于單獨用藥，可能與二者聯合用藥發揮活血化瘀與神經保護作用有關。

腦缺血再灌注損傷；羥基紅花黃色素A；芍藥苷

腦卒中是全球第二大、中國第一大的致死性疾病，具有死亡率、發病率、致殘率和復發率高及并發癥多的特點。腦卒中分為缺血性和出血性兩類，其中缺血性卒中約占80%。隨著中國人口老齡化的進程，急性缺血性腦卒中不僅成為中國第一位死亡原因，且患病率呈上升趨勢及年輕化趨勢[1-2]。近年研究發現羥基紅花黃色素A(HSYA)與芍藥苷單獨應用具有對抗腦缺血再灌注損傷的作用[3-6]，但未見二者聯合用藥用于預防和治療腦缺血再灌注損傷的報道。本研究通過改良線栓法復制局灶性腦缺血再灌注模型，觀察HSYA與芍藥苷聯合用藥對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠120只，體質量180～220 g，廣州中醫藥大學(大學城)實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK(粵)2013-0020。

1.2 藥品及試劑

羥基紅花黃色素A(Hydroxy safflower yellow A，HSYA)(質量分數89.5%，成都康邦生物科技有限公司，批號160301)；芍藥苷(質量分數98%，南京澤朗生物科技有限公司，批號20150723)；銀杏內酯注射液(成都百?？萍贾扑幱邢薰荆?8150404)；Akt(Phospho-Ser473)抗體(Abcam公司，批號GR240003-Ⅱ)；4%(φ)多聚甲醛(廣州昂飛生物科技有限公司，批號153814)；TTC試劑(Sigma公司，批號206-07-6)。

1.3 主要儀器

高速低溫離心機(美國 Thermo 公司)；Elx800TM酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)；電子分析天平(上海精密科學儀器有限公司)。

1.4 模型構建與分組、給藥

雄性SD大鼠120只，隨機分為6組：HSYA組(5.0 mg/kg)、芍藥苷組(5.0 mg/kg)、HSYA與芍藥苷聯合用藥組(各5.0 mg/kg)、銀杏內酯組(5 mg/kg)、模型組和假手術組(假手術組10只，模型組20只，其余每組20只)。適應性飼養1周后，禁食不禁水12 h，參照文獻[7]方法沿頸部正中線縱向切口，分離右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內動脈(ICA)。使線栓通過CCA分叉部進入ICA，結扎ICA切口和栓線，1 h后抽出栓線，再灌注6 h，造成大腦中動脈栓塞(MCAO)動物模型。假手術組暴露右側頸部血管，不進行栓塞處理，其余同手術組。給藥前觀察大鼠體征，對大鼠神經功能缺失進行評分。評分標準：無神經病學征象為0分；提尾時左前肢不能完全伸直為1分；向左側轉圈為2分；向左側跌倒為3分；無自發活動及意識障礙者為4分。造模成功的標志是評分為1～4分的大鼠，不成功者予以剔除。腦缺血再灌注6 h后尾靜脈注射給藥，每天1次，連續給藥7 d，假手術組和模型組給予等量注射用生理鹽水。取材前后進行神經功能評分。

1.5 大鼠腦梗死面積測定

末次給藥2 h后，再次進行神經功能缺失評分后麻醉大鼠，頸椎脫臼處死大鼠，快速開顱取腦，去掉嗅球、低位腦干和小腦，-20 ℃冰箱中冷凍15 min后取出，參照文獻[8]方法進行TTC染色。經染色后非缺血區為紅色，缺血區為白色。用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量紅、白區域面積，計算梗死面積比。梗死面積比=Σ梗死面積/Σ全腦片面積。

1.6 大鼠皮質區病理學觀察

參照文獻[9]的方法進行大鼠腦組織HE染色，光鏡下觀察皮質區神經細胞的形態學變化。

1.7 大鼠腦梗死區p-Akt表達的測定

大鼠頸椎脫臼處死后，開顱取腦，制作石蠟塊及切片，然后嚴格按照試劑盒的步驟操作，進行免疫組化的制片。應用Image-Pro Plus6.0 軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統一標準，對每張照片進行分析得出每張照片陽性的吸光度值(A)。

1.8 統計學處理

2 結果

2.1 大鼠的一般狀況

假手術組大鼠毛發有光澤，飲食飲水正常，精神狀態佳，手術24 h后體質量持續上升。模型組大鼠毛發無光澤，飲食飲水減少，精神萎靡，手術后大部分大鼠的體質量持續降低，嚴重者左側前肢殘廢，左眼變瞎。各給藥組大鼠的表現介于假手術大鼠與模型組之間。合用組大鼠的外在表現較HSYA組和芍藥苷組大鼠好。

2.2 HSYA與芍藥苷聯合用藥對MCAO再灌注大鼠治療24 h體質量變化的影響

與假手術組比較，模型組大鼠術后24 h內體質量明顯減輕，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，銀杏內酯組、合用組、芍藥苷組、HSYA組大鼠術后24 h內體質量明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)，說明各給藥組可以不同程度地抑制局灶性腦缺血再灌注大鼠體質量下降；與合用組比較，芍藥苷組、HSYA組大鼠術后體質量明顯減輕，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)，說明HSYA與芍藥苷聯合用藥效果較二者單獨給藥效果好。見表1。

表1 HSYA與芍藥苷聯合用藥對大鼠治療24 h體質量變化的影響

組別n治療24h體質量變化率/%假手術組10-3.94±1.57模型組15-16.81±2.73##銀杏內酯組12-13.11±2.84**合用組11-11.99±2.40**芍藥苷組13-14.67±1.42*&&HSYA組12-14.31±1.98**&

與假手術組比較：##P<0.01； 與模型組比較:*P<0.05,**P<0.01； 與合用組比較:&P<0.05，&&P<0.01。

2.3 HSYA與芍藥苷聯合用藥對MCAO再灌注大鼠治療前后神經功能缺失評分的影響

與假手術組比較，模型組大鼠治療前評分明顯高于假手術組，差異具有統計學意義(P<0.01)，說明造模成功。與模型組比較，HSYA組、芍藥苷組、合用組、銀杏內酯組大鼠治療前后神經功能缺失評分變化均有顯著變化，差異有統計學意義(P<0.01)，說明各給藥組具有不同程度的改善局灶性腦缺血再灌注大鼠神經功能缺失的作用。見表2。

表2 HSYA與芍藥苷聯合用藥對大鼠神經功能缺失評分的影響

組別n治療前評分治療后評分治療前后評分變化假手術組10000模型組101.80±0.63##1.30±0.48##0.30±0.82銀杏內酯組82.13±0.990.75±0.47*1.25±0.89**合用組112.00±0.770.46±0.69**1.73±0.65**芍藥苷組92.00±0.500.78±0.44*1.22±0.44**HSYA組92.11±0.930.78±0.67*1.44±0.53**

與假手術組比較：##P<0.01； 與模型組比較:*P<0.05，**P<0.01。

2.4 HSYA與芍藥苷聯合用藥對MCAO再灌注大鼠腦梗死面積的影響

與假手術組比較，模型組的腦梗死面積顯著增大，差異有統計學意義(P<0.01)，說明造模成功；與模型組比較，銀杏內酯組、合用組、芍藥苷組、HSYA組的腦梗死面積均顯著減小，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)，見表3、圖1。

表3 HSYA與芍藥苷聯合用藥對大鼠腦梗死面積的影響

組別n腦梗死面積比/%假手術組100模型組1043.46±4.56##銀杏內酯組826.35±9.27**合用組1124.12±9.22**芍藥苷組929.45±2.60*HSYA組926.05±10.69**

與假手術組比較：##P<0.01； 與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01。

假手術組模型組銀杏內酯組合用組芍藥苷組HSYA組

圖1 各組大鼠腦缺血再灌注損傷腦組織TTC染色

Figure 1 TTC staining of brain tissue after cerebral ischemia-reperfusion injury in each group

2.5 HSYA與芍藥苷聯合用藥對MCAO再灌注大鼠腦組織皮質區病理學的影響

假手術組腦組織無缺血表現，右側腦結構完整，皮質區結構清晰完整，未見明顯損傷及病變；模型組皮質區大量液化性壞死灶，結構不清晰，神經細胞大量死亡，未見正常神經元細胞；與模型組比較，銀杏內酯組、合用組、芍藥苷組和HSYA組皮質區液化性壞死灶較小，壞死神經元細胞數量相對較少；與合用組比較，芍藥苷組和HSYA組液化性壞死灶較大，壞死神經元細胞數量相對較多。見圖2。

2.6 HSYA與芍藥苷聯合用藥對MCAO再灌注大鼠腦梗死區p-Akt(Akt1)表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠腦梗死區p-Akt表達顯著增加，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，HSYA組、芍藥苷組、合用組、銀杏內酯組大鼠腦梗死區p-Akt表達顯著增加，差異有統計學意義(P<0.01)；與合用組比較，HSYA組、芍藥苷組、銀杏內酯組大鼠腦梗死區p-Akt表達顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)。見表4，圖3。

A.假手術組; B.模型組; C.銀杏內酯組; D.合用組; E.芍藥苷組; F.HSYA組。

圖2 各組大鼠海馬皮質區神經細胞HE染色(100×)

Figure 2 HE staining of neurons in hippocampal cortex of each group of rats

表4 HSYA與芍藥苷聯合用藥對大鼠腦梗死區p-Akt1表達的影響

組別nA假手術組60.023±0.0013模型組70.040±0.0014##銀杏內酯組70.076±0.0030**&&合用組80.104±0.0022**芍藥苷組70.069±0.0019**&&HSYA組70.064±0.0039**&&

與假手術組比較：##P<0.01； 與模型組比較：**P<0.01； 與合用組比較：&&P<0.01。

A.假手術組; B.模型組; C.銀杏內酯組; D.合用組; E.芍藥苷組; F.HSYA組。

圖3 各組大鼠腦梗死區免疫組化染色(100×)

Figure 3 IHC staining of neurons in hippocampal cortex of each group of rats

3 討論

腦組織缺血一定時間后再恢復血液灌注，腦組織的損傷反而會進一步的加重，這種損傷即是腦缺血再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷在腦血管病的發生、發展過程中起著重要作用，因此保護腦缺血再灌注損傷是治療腦缺血成功的關鍵。腦缺血再灌注損傷發生后，從損傷機制上看臨床上改善損傷的藥物主要為抗血小板聚集、神經保護劑、抗氧化等藥物[10-11]。腦缺血疾病主要由血栓形成影響，而缺血后炎癥反應可導致神經功能缺失，因此利用抗血小板藥物抑制血小板激活,不僅可以預防血栓的形成還可以減輕由血小板激活誘發的炎癥反應[12-13]。

有學者[14]提出“以組分配伍來研制現代中藥”的新型模式后，中藥組分配伍不僅受到中醫藥學界的關注而且已成為目前方劑配伍研究的熱點。中藥組分配伍是對應用較為廣泛、療效顯著的中藥或方劑進行深入的研究，在藥效成分已知、作用機制比較明確的前提下，選取中藥的有效部位或有效成分，運用現代藥理技術對配伍組分進行優化篩選，最終得到具有最佳治療效果的組成及配比[15]。HSYA與芍藥苷對大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用，但作用機制不同。芍藥苷是赤芍的主要有效單體成分，研究證明其具有抗自由基損傷、抗神經毒性、抗血小板聚集、改善微循環、抗氧化及抗驚厥等作用，國內外的進一步研究發現其具有神經保護作用[16]。羥基紅花黃色素A( HSYA) 是紅花的主要有效單體成分，其主要作用是抗血小板聚集(活血化瘀)[17]。

PI3K/Akt信號通路參與神經系統中神經元及神經膠質細胞的生存、分化，PI3K/Akt的激活對腦缺血再灌注損傷具有神經保護作用[18-19]。Akt是PI3K下游主要信號分子及PI3K信號轉導途徑中重要的靶激酶，是一種絲氨酸(Ser473)/蘇氨酸(Thr308)蛋白激酶[18]，是調節細胞生長及抗凋亡的重要分子。Akt1、Akt2及Akt3是Akt的亞型，其作用分別是Akt1促進細胞的增殖、Akt2參與胰島素調節代謝的過程、Akt3對細胞的生長及分化起著重要的調節作用[19]。在大腦中Akt1、Akt3的表達豐富，在心臟及棕色脂肪組織中Akt2表達較大腦中豐富，因此在大腦中Akt1、Akt3的功能比Akt2更重要[20]。激活的Akt能夠向細胞質和細胞核內轉運，活化的Akt通過磷酸化作用激活或抑制下游靶蛋白，進而調節細胞的凋亡、增殖、分化、遷移等過程。

本研究發現，給藥7 d后各給藥組大鼠的腦梗死面積較模型組小，治療前后神經功能缺失評分變化與模型組相比差異顯著，皮質區的病理變化情況與模型組相比損傷較??；腦缺血再灌注模型復制成功后模型組大鼠24 h內體質量明顯下降，這與文獻[21]報道一致，各給藥組與模型組相比24 h內下降較少，給藥2～3 d后體質量開始增加。腦梗死面積、神經功能缺失評分和造模后體質量變化情況可以共同作為評判腦缺血造模成功的標準及藥物預防及治療的效果；PI3K/Akt通路的激活對腦缺血再灌注損傷具有重要的保護作用，給藥7 d后各給藥組大鼠腦梗死區磷酸化Akt1的表達量與模型組相比差異顯著，這與文獻[ 6,16 ]報道中HSYA、芍藥苷對腦缺血再灌注損傷的保護作用一致，合用組大鼠腦梗死區磷酸化Akt1的表達量顯著高于HSYA組、芍藥苷組及銀杏內酯組，表明HSYA與芍藥苷聯合用藥可以上調腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死區磷酸化Akt1的表達，合用效果較單獨用藥效果好。

本研究結果提示，HSYA與芍藥苷聯合用藥對腦缺血再灌注的損傷具有協同保護作用，這可能與二者聯合用藥發揮活血化瘀與神經保護的作用有關。

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(責任編輯：幸建華)

Synergistic protective effect of hydroxy safflower yellow A and paeoniflorin on cerebral ischemia reperfusion injury in rats

QIN Shasha1,YU Mengli2,LIAO Jinming3,XU Yulin2,ZHENG Lixian3,ZHU Yuan3,LI Lei1,YAO Hui4,ZHANG Jiping4,HAN Bin1

(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.SchoolofPharmacy,GuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524023,China; 3.CollegeofTraditionalChineseMedicine,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China; 4.TheAffiliatedFoshanHospitalofSouthernMedicalUniversity,Foshan528000,China)

Objective To study the synergistic protection and mechanism of hydroxy safflower yellow A(HSYA) and paeoniflorin in acute focal cerebral ischemia reperfusion injury in rats. Methods 110 male SD rats were randomly divided into six groups,including HSYA group(5.0 mg/kg),paeoniflorin group (5.0 mg/kg),HSYA combined with paeoniflorin group (5.0 mg/kg),gingko lactone group(5.0 mg/kg),the model group and the sham group. The model of rat middle cerebral artery occlusion(MCAO) was replicated by modified thread embolism method. Nerve function loss was scored and drugs were administrated by intravenous injection after 1 h cerebral ischemia and 6 h reperfusion. Neurological deficit was revalued after 7 day treatment. The area of cerebral infarction was detected by triphenyl tetrazolium chloride(TTC) staining. The expression of phosphorylated Akt1 protein was identified by immunohistochemistry(IHC). Results Compared with the sham group,the scores of the pre-treatment rats in the operation group were significantly higher than those in the sham-operation group(P<0.01),indicating that the model was successful. Compared with the model group,the loss of body weight,neurological deficits,cortical cell damage and cerebral infarction area were all attenuated,but the expression of phosphorylated Akt1 was increased in four drug-treated groups(P<0.05 orP<0.01). Meanwhile,compared with the combination of HSYA and paeoniflorin group,the expression of phosphorylated Akt1 was lower in other three groups(P<0.01). Conclusion HSYA combined with paeoniflorin displays a synergistic protection against cerebral ischemia and reperfusion injury,which is better than single drug treatment.

cerebral ischemia-reperfusion injury; HSYA; paeoniflorin

2016-09-01

廣東省自然科學基金項目(S2013010012284)；廣東省中醫藥局課題(20152074)；佛山市醫學重點?？婆嘤椖?Fspy2-2015008)

秦莎莎(1989—)，女， 2014級碩士研究生，Email:1696505488@qq.com；通信作者:張繼平(1964—)，男，研究員，主要從事中藥復方藥理研究，Email：fszjping@163.com;韓彬(1964—)，男，教授，主要從事方劑配伍及代謝性疾病研究，Email：hblz99@21cn.com。

時間：2016-11-29 11:10

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161129.1110.008.html

R965

A

1006-8783(2016)06-0747-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016090101