人參皂苷Rg5對人食管癌細胞作用的研究

梅志宏,丁雅明,李 凡,付學奇，劉林林*，朱洪權*

(1.吉林大學第二醫院，吉林 長春130041;2.吉林大學基礎醫學院；3.吉林大學生命科學院)

人參皂苷Rg5對人食管癌細胞作用的研究

梅志宏1,丁雅明1,李 凡2,付學奇3，劉林林1*，朱洪權1*

(1.吉林大學第二醫院，吉林 長春130041;2.吉林大學基礎醫學院；3.吉林大學生命科學院)

目的 探索人參皂苷Rg5對人食管癌細胞Eca-109的作用及機制。方法 利用不同濃度人參皂苷Rg5在體外對人食管癌Eca109細胞作用不同時間，采用CCK-8法檢測細胞抑制率，Annexin V-FITC/PI雙染色后流式細胞儀檢測細胞凋亡率，PI單染法檢測細胞周期。結果 在濃度分別為50、100 μmol/L的人參皂苷Rg5作用人食管癌細胞24 h后出現明顯形態學變化，同時處于S期及G2/M期細胞較對照組明顯增多,分別為53.08%、25.84%和58.44%、31.48%，流式細胞儀檢測早期凋亡率分別為11.45%、30.13%。 結論 人參皂苷Rg5能抑制食管癌Eca-109細胞增殖，其機制可能為增加細胞早期凋亡，引起細胞周期滯留。

人參皂苷Rg5；食管癌細胞Eca109；細胞周期；凋亡

(ChinJLabDiagn,2016,20:1982)

食管癌是常見的消化道腫瘤，2008年其全世界平均發病率居所有惡性腫瘤第9位；死亡率居第8位，而中國大陸食管癌發病率居全國各類惡性腫瘤第5位，死亡率高居第4位，顯著高于國際平均水平[1]。居高不下的發病率及死亡率嚴重威脅人類的健康。目前食管癌的治療手段主要是手術及放化療治療。因其解剖位置特殊，治療效果一般，預后較差,應用新型藥物延緩其復發和轉移是提高其治療療效的手段之一。

人參皂苷Rg5是從人參中提取的稀有人參皂苷，Rg5能誘導多種腫瘤細胞凋亡，Shin-jung Kim[2]等人從細黑參中提取的Rg5已驗證在人乳腺癌細胞(MCF-7、MDA-MB-453)、Li-dan Liang[3]等報道Rg5能誘導多種宮頸癌細胞凋亡和DNA損傷,然而在該人參單體對食管癌細胞的作用未見報道。本研究通過體外細胞實驗證實人參皂苷Rg5對食管癌細胞具有抑制增殖作用，為臨床治療腫瘤開發新型中藥提供一定的實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株

該實驗采用的食管癌細胞株Eca109細胞由吉林大學第二醫院中心實驗室保存。

1.1.2 人參皂苷Rg5

該實驗所用人參皂苷Rg5單體由吉林大學生命科學院從人參中分離及提供本次實驗。

1.1.3 主要試劑及實驗耗材

RPMI-1640培養基購自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購自由NQBB公司；青-鏈霉素雙抗購自Gibco公司；凋亡檢測試劑盒Annexin V-FITC/PI為BD公司產品，周期檢測試劑盒購自南京凱基生物公司，CCK-8為日本同仁產品。37℃恒溫培養箱、酶標儀為Thermo公司設備，流式細胞儀為Beckman公司儀器。

1.2 方法

1.2.1 食管癌細胞抑制率檢測

采用cck-8法檢測細胞抑制率。取對數生長期的食管癌ECa109細胞4×104/ml，種于96孔板中，每孔100 μl，37℃孵育箱中培養24 h，并將Rg5稀釋于不含血清的RPMI-1640培養基中，濃度分別為6.25、12.5、25、50、100 μmol/L共5個濃度梯度，每組5個復孔，同時每組設置對照組(不加藥物)，空白組(只含培養基)，細胞種于96孔板培養24 h后吸去完全培養基，每孔加入100 μl上訴含有不同藥物濃度的培養基，空白組及對照組也相應加入不含血清培養基，37℃孵育箱繼續培養24 h后每孔加入10 μl CCK-8,2h后酶標儀檢測450 nm處吸光度。全部細胞抑制率=(對照組-加藥組)/(對照組-空白組)×100%。

1.2.2 細胞生長狀態觀察

取對數生長期的Eca109細胞消化后種于6孔板中，每孔約3×105個。以每孔2 ml完全培養基下37℃培養箱中培育24 h，根據藥物的濃度曲線及時間曲線，更換含有50、100 μmol/L藥物濃度的不含血清培養基2 ml恒溫箱培養24 h，同時設立對照組(不含藥物)，倒置顯微鏡下觀察其形態。

1.2.3 細胞凋亡檢測

以Annexin V FITC/PI雙染色法檢測。取對數生長期的Eca109細胞消化后種于6孔板中，每孔約3×105個。以每孔2 ml完全培養基下37℃培養箱中培育24 h，根據藥物的濃度曲線及時間曲線，更換含有50、100 μmol/L藥物濃度的不含血清培養基2 ml恒溫箱培養24 h，同時設立對照組(不含藥物)。收集上述細胞及上清，1 000 rpm離心5 min后棄去上清，預冷的PBS洗2次，用1×緩沖液重新懸浮細胞，調節其濃度為1-5×106/ml，取100 ul上訴細胞懸液于5 ml流式管中，分別加入5 μl Annexin V/FITC和5 μl PI，室溫避光15 min，流式細胞儀測定細胞凋亡，實驗重復3次。

1.2.4 細胞周期檢測

以PI(碘化丙啶)單染法檢測。取對數生長期的細胞種于6孔板中，每孔3×105個，2 ml完全培養基37℃孵育24 h，更換含有Rg5濃度為50、100 μmol/L的培養基2 ml培養24 h，同時設對照組。收集培養基，每孔1 ml胰酶消化收集后離心1 000 rpm、5 min，PBS洗滌1次離心，棄去上清后加入預冷的體積分數為70%乙醇5 ml固定，4℃過夜，800 rpm離心5 min后PBS洗去固定液，加入配好的含有染色緩沖液、Rnase、PI的染色液400 μl，37℃避光水浴30 min后進行流式細胞檢測，Modfit軟件分析細胞周期，實驗重復3次。

1.2.5 統計學分析

2 結果

2.1Rg5對細胞增殖的抑制作用 不同濃度的Rg5對Eca-109細胞作用后抑制其增殖，且隨著濃度和時間的增加，其抑制率相應增加，經過SPSS軟件分析，其24h的IC50為42.95μmol/L，48h的IC50為31.61μmol/L，我們選擇近50、100μmol/L濃度進行以下實驗。如表1。

Rg5作用Eca109細胞的時間不同，其細胞抑制率不同，隨時間延長其抑制率增加，以50μmol/L濃度的Rg5觀察不同時間對Eca109的抑制率，見表2。

表1 不同濃度Rg5作用不同時間后細胞抑制率( ±s，%)

表2 50 μmol/L的Rg5與食管癌細胞作用不同時間抑制率

2.2 不同濃度與Eca-109細胞作用后生長情況 鏡下可見，隨濃度增加，細胞形態發生明顯變化，其體積變小，部分出現皺縮、變圓、脫落(圖1)。

2.3 Rg5對Eca109細胞周期的影響 食管癌細胞的周期受到Rg5的影響，隨著濃度的增加，其周期主要阻滯在G2/M、S期，而G0/G1比例相對減低。當以50、100 mol/L濃度作用細胞24 h后，其S期、G2期與對照組相比，有明顯的差異性，具有統計學意義(P<0.05)。見表3。

圖1 不同濃度Rg5作用Eca-109細胞24 h后形態觀察

組別G0/G1SG2/M對照組51．64±3．2238．22±2．8512．14±2．4650μmol/L組21．08±2．18?53．08±3．34?25．84±3．08?100μoml/L組10．08±2．41?58．44±4．05?31．48±4．54?

注：*與對照組相比，P<0.05

2.4 Rg5對Eca109細胞增殖的影響 分別用50、100 μmol/L濃度Rg5作用Eca109細胞后可見細胞凋亡率增加，且隨濃度增加其早期凋亡率也增加。當以50、100 μmol/L濃度作用細胞24 h后，其早期凋亡率與對照組相比，有明顯的差異性，具有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同濃度Rg5作用Eca109細胞24 h凋亡情況

注：C1:壞死細胞；C2：晚期凋亡細胞；C3：正常細胞；C4：早期凋亡細胞；與對照組比較，*P<0.05

3 討論

腫瘤的生長是一個復雜的過程，因其不能像正常細胞一樣進行程序化凋亡而進行無限增殖，因此，如何誘導腫瘤細胞凋亡或產生細胞周期滯留致使細胞停止分裂或延遲分裂，是藥物治療腫瘤的最基本的幾種作用方式。

人參是祖國傳統醫學中重要的藥物，隨著醫學科技的發展，其多種成分已被分離出來形成單體[4]，其中人參皂苷Rg3，已被制成抗腫瘤中藥應用于臨床。Rg5作為一種新型人參單體，目前正被用于多種研究，Lee YY[5]等研究了Rg5在BV2小膠質細胞中的抗炎作用，Siddiqi[6]等報道了其在小鼠成骨細胞中的刺激作用，Chu[7]等人研究了人參皂甙Rg5通過減弱神經炎癥反應改善STZ誘導記憶受損大鼠的認知功能障礙和β-淀粉樣蛋白沉積等。本實驗通過體外細胞實驗證明其對食管癌細胞具有增殖抑制作用，這與之前報道的Rg5能誘導其他腫瘤細胞凋亡一致。本實驗發現其抑制腫瘤細胞增殖通過影響細胞周期，主要是將細胞周期阻滯在S期和G2期，從而表現出其細胞毒作用，同時引發腫瘤細胞凋亡，并隨著濃度增加，其凋亡率也相應增加。目前已有多項研究證實細胞周期阻滯與細胞周期蛋白的表達有關，而細胞凋亡途徑主要有細胞膜途徑，線粒體途徑和內質網途徑三種。當細胞經過藥物作用后，經過某一種途徑使細胞接受凋亡信號，會使凋亡調控分子進行相互作用，繼而誘發細胞凋亡相關蛋白的活化，致使細胞凋亡。 Rg5誘導的細胞周期改變和早期凋亡的發生是否與上訴因素有關，還有待進一步研究。總體說來，本次實驗證實人參皂苷Rg5能在體外實驗中抑制食管癌細胞增殖，為臨床開發治療食管癌新藥提供一定的實驗基礎。

[1]赫 捷,邵 康.中國食管癌流行病學現狀、診療現狀及未來對策[J].中國癌癥雜志,2011,21(7):501.

[2]Shin-jung Kim，An Keun Kim,Anti-breast cancer activity of Fine Black ginseng (Panax ginseng Meyer) and ginsenoside Rg5[J].Journal of Ginseng Research,2015,39(2):125.

[3]Liang LD,He T,Du TW,et al,Ginsenoside-Rg5 induces apoptosis and DNA damage in human cervical cancer cells[J].Molecular Medicine Reports,2015,11(2):940.

[4]楊金玲,高麗麗,朱 平.人參皂苷生物合成研究進展[J].藥學學報，2013,48(2):170.

[5]Lee YY，Park JS，Jung JS，et al.Anti-inflammatory effect of ginsenoside Rg5 in lipopolysaccharide-stimulated BV2 microglial cells[J].Int J Mol Sci,2013,14(5):9820.

[6]Siddiqi MH，Siddiqi MZ，Ahn S，et al.Stimulative Effect of Ginsenosides Rg5:Rk1 on Murine Osteoblastic MC3T3-E1 Cells[J].Phytotherapy Research,2014，28(10):1447.

[7]Chu SH，Gu JF，Feng L,et al.Ginsenoside Rg5 improves cognitive dysfunction and beta-amyloid deposition in STZ-induced memory impaired rats via attenuating neuroinflammatory responses[J].Int Immunopharmacol,2014，19(2):317.

Effect of ginsenoside Rg5 on human esophageal cancer cells

MEIZhi-hong,DINGYa-ming,LIFan,etal.

(TheSecondHospitalofJilinUniversity，Changchun130041，China)

Objective To explore the effect and mechanism of ginsenoside Rg5 on human esophageal cancer cell line Eca-109.Methods The inhibitory rate of human esophageal cancer cell line Eca109 in vitro was measured by CCK-8 method.The apoptosis rate of cells was detected by flow cytometry after Annexin V-FITC / PI double staining.Cell cycle.Results After treated with ginsenoside Rg5 at concentrations of 50 and 100 μmol/L for 24 h,the morphological changes were observed,and the cells in S phase and G2/M phase were significantly higher than those in the control group (53.08%,25.84%% and 58.44%,31.48% respectively(P<0.05).The early apoptotic rates were 11.45% and 30.13% respectively by flow cytometry(P<0.05).Conclusion Ginsenoside Rg5 can inhibit the proliferation of esophageal cancer Eca-109 cells,and its mechanism may be to increase the early apoptosis of cells,causing cell cycle arrest.

ginsenoside Rg5;esophageal cancer cell Eca 109;cell cycle;apoptosis

國家自然科學基金重大國際合作項目(項目編號：81320108025)

1007-4287(2016)12-1982-04

R735.1

A

2016-05-09)

*通訊作者