蛋白激酶SGK3過表達促進乳腺癌細胞株MDA-MB-231增殖和侵襲

鄒祥南，張國揚，劉忠豪，杜雪峰，郭紅艷，孫曉杰

(齊齊哈爾醫(yī)學院 1.12級檢驗專業(yè)；2.14級口腔專業(yè)；3.14級影像專業(yè)；4.生物化學教研室,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

蛋白激酶SGK3過表達促進乳腺癌細胞株MDA-MB-231增殖和侵襲

鄒祥南1，張國揚2，劉忠豪3，杜雪峰1，郭紅艷4*，孫曉杰4*

(齊齊哈爾醫(yī)學院 1.12級檢驗專業(yè)；2.14級口腔專業(yè)；3.14級影像專業(yè)；4.生物化學教研室,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的 研究血清和糖皮質(zhì)激素誘導的蛋白激酶3(SGK3)過表達對乳腺癌細胞克隆增殖和侵襲行為的影響及其機制。方法 免疫組化方法檢測不同類型乳腺癌組織中SGK3蛋白的表達；通過GenEscortTMⅠ介導用重組質(zhì)粒pEGFPN1-SGK3瞬時轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-231細胞，免疫印跡方法對轉(zhuǎn)染細胞中的蛋白表達進行鑒定；克隆形成實驗觀察SGK3過表達對單個細胞克隆增殖的影響；細胞侵襲實驗觀察細胞侵襲能力的變化；免疫印跡方法檢測腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達。結(jié)果 SGK3在乳腺浸潤性導管癌的表達明顯高于正常乳腺組織和乳腺纖維腺瘤組織(P<0.05)。過表達SGK3的MDA-MB-231細胞，其克隆形成和侵襲力均增強，與對照組細胞相比，均有顯著性差異(P<0.01)。SGK3過表達不影響乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制因子1(BRMS1)的表達，但卻使MMP2和MMP9的表達明顯升高。結(jié)論 SGK3在乳腺浸潤性導管癌組織中呈高表達，SGK3過表達可通過上調(diào)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP2和MMP9的表達而促進乳腺癌細胞的侵襲。

SGK3；乳腺癌；侵襲；MMP2；MMP9

(ChinJLabDiagn,2016,20:1990)

血清和糖皮質(zhì)激素誘導的蛋白激酶3(SGK3)是近年來新發(fā)現(xiàn)的PI3K下游信號分子，其與人類乳腺癌、肝癌、大腸癌、前列腺癌等多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)[1-4]。由于SGK3在結(jié)構(gòu)上與PI3K 的下游分子Akt/PKB高度同源，且二者具有相似的上游和下游靶點，因此推測SGK3很可能和Akt/PKB具有相似的細胞內(nèi)功能。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，SGK3在乳腺癌細胞MCF-7中高表達能夠促進細胞增殖、抑制細胞凋亡[5]。本文在此基礎(chǔ)上，利用組織芯片技術(shù)檢測SGK3在不同類型乳腺癌中的表達，并在細胞水平觀察SGK3過表達對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移細胞系MDA-MB-231侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響，為闡明SGK3的功能以及靶向PI3K/SGK3的抗腫瘤藥物研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 組織芯片、質(zhì)粒和細胞株 乳腺癌組織芯片BR1503d購自西安艾麗娜生物科技有限公司；重組質(zhì)粒pEGFPN1-SKG3含有人SGK3 cDNA基因，由本室郭紅艷博士構(gòu)建[6]，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌擴增后用于本實驗研究。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移細胞系MDA-MB-231由本室凍存，細胞復蘇后用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試劑和抗體 RPMI1640和G418為GibcoBRL公司產(chǎn)品 新生小牛血清、胰酶為Invitrogen公司產(chǎn)品；細胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板為丹麥Nunc公司產(chǎn)品；Transwell培養(yǎng)板為美國Costar公司產(chǎn)品；GFP、MMP2、MMP9、BRMS1以及β-actin抗體為CST公司產(chǎn)品；HRP-IgG和ECL發(fā)光試劑盒為Santa Cruz公司產(chǎn)品；UltraSensitiveTM S-P超敏試劑盒(鼠/兔)、DAB顯色試劑盒為福州邁新生物技術(shù)公司產(chǎn)品；DEL2000蛋白分子量標準和結(jié)晶紫為鼎國生物公司產(chǎn)品；垂直板電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)MINI型、GEL Doc 2000數(shù)字成像系統(tǒng)為美國BioRad公司產(chǎn)品。

1.3 主要方法

1.3.1 免疫組化 乳腺癌組織芯片(BR1503d)為組織微陣列芯片，含正常乳腺組織及乳腺纖維腺瘤各3例、浸潤性導管癌60例，芯片樣本取自臨床19-74歲女性病例，免疫組化方法進行檢測，光鏡下呈棕黃色判定為SGK3表達陽性，用Imagepro-PLus軟件測定IOD值，分析SGK3的表達情況。

1.3.2 基因轉(zhuǎn)染 采用GenEscortTMⅠ介導進行基因轉(zhuǎn)染，具體操作按說明書進行。將生長狀態(tài)良好的細胞于轉(zhuǎn)染前一天接種到6孔培養(yǎng)板中，待細胞總面積達到60-80%，取pEGFPN1和pEGFPN1-SGK3質(zhì)粒各3 μg進行瞬時轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染細胞分別命名為231/pEGFPN1和231/ pEGFPN1-SGK3，48小時后提取細胞總蛋白，用抗GFP抗體對轉(zhuǎn)染細胞的蛋白表達進行鑒定。

1.3.3 克隆形成實驗 將MDA-MB-231、231/pEGFPN1和231/ pEGFPN1-SGK3細胞按103個/孔接種于6孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3個平行孔，每周換液2-3次，2周后觀察克隆形成情況。經(jīng)甲醇固定、0.4%結(jié)晶紫染色后，計數(shù)克隆數(shù)，并以形成的克隆數(shù)除以接種細胞數(shù)，計算克隆形成率。

1.3.4 細胞侵襲實驗 細胞無血清培養(yǎng)24 h，0.25%胰酶消化細胞，PBS洗2遍，用含0.2%血清的培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度至2×105/ml，取細胞懸液200 μl加入基質(zhì)膠包被好的Transwell侵襲小杯，每組3個復孔，孔板下室加入600 μl含10%血清培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h。取出Transwell侵襲小杯，PBS沖洗后用棉簽輕輕擦掉杯底膜上層的未遷移細胞，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS沖洗，顯微鏡下隨機觀察5個視野記數(shù)并拍照。

1.3.5 免疫印跡實驗 提取各組細胞總蛋白，Bradford法蛋白定量后進行SDS-PAGE及轉(zhuǎn)膜。封閉液中室溫封閉2 h；按1∶500-1∶1000分別稀釋一抗MMP2、MMP9、GFP 、BRMS1以及β-Actin，4℃過夜；TTBS漂洗3次，每次10 min；再按1：1000稀釋二抗，室溫孵育1 h；用TTBS室溫漂洗后進行ECL顯色。利用GEL Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)及其圖像分析軟件Multi-AnalystR/PC對Western Blot雜交帶進行密度掃描分析。

1.3.6 統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用方差分析，采用LSD、Dunnett T3方法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 蛋白激酶SGK3在不同類型乳腺癌組織中的表達

免疫組化實驗結(jié)果如圖1所示，SGK3在乳腺癌癌旁組織、乳腺纖維腺瘤以及乳腺浸潤性導管癌中均有表達，但在癌旁組織(IOD=199.95±52.92)和乳腺纖維腺瘤(IOD=160.48±48.45)中的表達量無明顯差異，而在乳腺浸潤性導管癌中的表達卻明顯增高(IOD=338.15±133.35)，與前兩組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 融合蛋白SGK3-GFP表達的鑒定

轉(zhuǎn)染48 h后，提取兩組細胞總蛋白，用抗GFP抗體進行免疫印跡檢測，結(jié)果在兩組細胞中均檢測到蛋白帶(圖2A)，其中轉(zhuǎn)染空載體組表達綠色熒光蛋白(GFP)，而轉(zhuǎn)染pGFPN1-SGK3組細胞表達融合蛋白SGK3-GFP，但兩組細胞的蛋白表達量無顯著差異(P>0.05)，見圖2B。

2.3 SGK3過表達促進乳腺癌細胞的克隆形成

克隆形成實驗結(jié)果顯示，在形成的克隆大小上三組細胞之間無明顯差異，但在克隆形成的數(shù)量上231/pEGFPN1-SGK3組明顯高于其他兩組。計算各組細胞的克隆形成率，結(jié)果MDA-MB-231和231/pEGFPN1組分別為15.8%±2.1%和16.9%±3.7%，而231/pEGFPN1-SGK3組為23.9%±4.3%，與前兩組細胞相比均有顯著性差異(P<0.01)，表明SGK3的表達能夠促進細胞的克隆增殖能力，見圖3。

圖1 免疫組化方法檢測乳腺癌組織中SGK3蛋白的表達 (40×)

圖2 免疫印跡方法鑒定MDA-MB-231細胞中融合蛋白SGK3-GFP的表達

圖3 SGK3過表達對MDA-MB-231細胞克隆形成能力的影響

2.4 SGK3過表達促進乳腺癌細胞侵襲

在Transwell侵襲實驗24 h后，親本細胞和空載體細胞組僅有少量細胞穿過，但過表達SGK3的MDA-MB-231細胞組可見大量細胞穿過，細胞計數(shù)結(jié)果MDA-MB-231、231/pEGFPN1以及231/pEGFPN1-SGK3組穿過的細胞數(shù)分別為55.4±9.68、60.6±10.92和115±16.71，與前兩組相比，有顯著性差異(P<0.05)，表明SGK3過表達能夠促進乳腺癌細胞通過基質(zhì)膠的侵襲行為(圖4)。

圖4 細胞侵襲實驗檢測各組細胞的侵襲能力

2.5 SGK3過表達對腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達的影響

免疫印跡實驗在各組細胞中均檢測到MMP2、MMP9以及BRMS1蛋白的表達，但各組細胞之間BRMS1的表達量無明顯差異(P>0.05)，而231/pEGFP-SGK3組MMP2和MMP9的表達量卻明顯高于其它兩組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖5)。

圖5 免疫印跡技術(shù)檢測各組細胞中MMP2、MMP9和BRMS1的表達

3 討論

SGK3屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其在哺乳動物組織和細胞中廣泛表達，通過磷酸化下游的靶蛋白而參與調(diào)控細胞增殖、存活、遷移以及物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運等[7-9]，與人類多種疾病包括腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)SGK3在正常乳腺組織、良性乳腺腫瘤以及乳腺浸潤性導管癌中均有表達，但其在浸潤性導管癌中的表達明顯高于前兩者，由此我們推測，SGK3的異常表達很可能與乳腺癌的浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)。為了探討SGK3與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，我們利用乳腺癌骨轉(zhuǎn)移細胞系MDA-MB-231為實驗材料，觀察SGK3過表達對細胞克隆增殖以及侵襲轉(zhuǎn)移行為的影響。結(jié)果顯示，高表達SGK3的細胞其單個細胞的克隆增殖能力以及細胞穿過基質(zhì)膠的侵襲能力均明顯高于對照組，由于腫瘤細胞對細胞外基質(zhì)(ECM)的降解是侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，因此本研究結(jié)果表明SGK3能夠促進腫瘤細胞的侵襲行為。

作為乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制因子，BRMS1高表達不僅能夠抑制乳腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移[10]，而且還能通過Stat3信號途徑參與非小細胞肺癌凋亡和轉(zhuǎn)移的調(diào)控[11]。但本研究發(fā)現(xiàn)，SGK3的高表達不影響乳腺癌細胞內(nèi)源性BRMS1的表達。由于腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力與其產(chǎn)生或誘導產(chǎn)生降解細胞外基質(zhì)或基底膜的蛋白酶有關(guān)，比如MMP2和MMP9在腫瘤轉(zhuǎn)移區(qū)域的表達明顯高于原發(fā)區(qū)域[12]，而且MMP2/MMP9可經(jīng)由PI3K/Akt信號通路誘導表達而促進腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移[13]。本研究證實，高表達SGK3的MDA-MB-231細胞其內(nèi)源性MMP-2 和 MMP-9 的表達均明顯升高，推測SGK3可通過調(diào)控MMP2/MMP9的表達而影響MDA-MB-231細胞的侵襲行為。

雌激素受體(estrogen receptor,ER)的表達與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、疾病預后以及患者生存期密切相關(guān)，ER+的乳腺腫瘤中SGK3的表達水平與患者的生存和預后呈正相關(guān)[14,15]，但迄今為止未發(fā)現(xiàn)Akt的表達與腫瘤預后的相關(guān)性。已知MDA-MB-231為ER-的乳腺癌細胞[16]，本研究發(fā)現(xiàn)SGK3過表達能夠促進該細胞的克隆增殖和侵襲行為，而我們前期研究發(fā)現(xiàn)SGK3促進ER+的乳腺癌細胞MCF-7遷移[17]，表明SGK3對乳腺癌細胞增殖和侵襲均有影響與ER受體的表達與否可能無關(guān)。但有關(guān)SGK3與ER-的乳腺癌患者生存和預后的相關(guān)性研究還需要大量的臨床病例資料分析，這也是我們下一步研究的方向。

[1] Gasser JA,Inuzuka H,Lau AW,et al.SGK3 mediates INPP4B-dependent PI3K signaling in breast cancer [J].Mol Cell,2014,56 (4):595.

[2]Liu M,Chen L,Chan TH,et al.Serum and glucocorticoid kinase 3 at 8q13.1 promotes cell proliferation and survival in hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2012,55(6):1754.

[3]Guo ST,Chi MN,Yang RH,et al.INPP4B is an oncogenic regulator in human colon cancer[J].Oncogene,2016,35(23):3049.

[4]Wang Y,Zhou D,Chen S.SGK3 is an androgen-inducible kinase promoting prostate cancer cell proliferation through activation of p70 S6 kinase and up-regulation of cyclin D1[J].Mol Endocrinol,2014,28 (6):935.

[5]郭紅艷,孫曉杰,劉秀財,等.血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶3過表達對乳腺癌細胞凋亡的影響[J].中國老年學雜志,2012,32(5):982.

[6]郭紅艷,孫曉杰,李淑艷,等.蛋白激酶SGK3基因的克隆及其在乳腺癌細胞中的表達[J].中國老年學雜志,2015,35(15):4187.

[7]Munoz C,Pakladok T,Almilaji A,et al.Up-regulation of Kir2.1 (KCNJ2) by the serum & glucocorticoid inducible?SGK3[J].Cell Physiol Biochem,2014,33(2):491.

[8]Pasham V,Rotte A,Bhandaru M,et al,Regulation of gastric acid secretion by the serum and glucocorticoid inducible kinase isoform SGK3[J].J Gastroenterol,2011,46(3):305.

[9] Schmid E,Bhandaru M,Nurbaeva MK,et al.SGK3 regulates Ca(2+) entry and migration of dendritic cells[J].Cell Physiol Biochem,2012,30(6):1423.

[10]Roesley SN,Suryadinata R,Morrish E,et al.Cyclin-dependent kinase-mediated phosphorylation of breast cancer metastasis suppressor 1 (BRMS1) affects cell migration[J].Cell Cycle,2016,15(1):137.

[11]You J,He X,Ding H,et al.BRMS1 regulates apoptosis in non-small cell lung cancer cells [J].Cell Biochem Biophys,2015,71(1):465.

[12]Nishio K,Motozawa K,Omagari D,et al.Comparison of MMP2 and MMP9 expression levels between primary and metastatic regions of oral squamous cell carcinoma[J].J Oral Sci,2016,58(1):59.

[13]Gao Y,Guan Z,Chen J,et al.CXCL5/CXCR2 axis promotes bladder cancer cell migration and invasion by activating PI3K/AKT-induced upregulation of MMP2/MMP9[J].Int J Oncol,2015,47(2):690.

[14]Wang Y,Zhou D,Phung S,et al.SGK3 is an estrogen-inducible kinase promoting estrogen-mediated survival of breast cancer cells [J].Mol Endocrinol,2011,25 (1):72.

[15]Xu J,Wan M,He Q,et al.SGK3 is associated with estrogen receptor expression in breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat,2012,134(2):531.

[16]Wu Q,Guo L,Jiang F,et al.Analysis of the miRNA-mRNA-lncRNA networks in ER+ and ER- breast cancer cell lines[J].J Cell Mol Med,2015,19(12):2874.

[17]郭紅艷,孫曉杰,劉秀財,等.血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶3(SGK3)過表達對乳腺癌細胞遷移的影響[J].中國實驗診斷學,2012,16(3):391.

Overexpression of protein kinase SGK3 promotes proliferation and invasion of breast cancer cell line MDA-MB-231

ZOUXiang-nan，ZHANGGuo-yang,LIUZhong-hao，etal.

(QiqiharMedicalUniversity,Qiqihar161006,China)

Objective To study the effect of serum and glucocorticoid induced protein kinase 3 (SGK3) overexpression on the proliferation and invasion of breast cancer cells.Methods To detect the expression of SGK3 protein in different types of breast cancer tissues by immunohistochemistry.Transient transfection of MDA-MB-231 cells with pEGFPN1-SGK3 plasmid mediated by GenEscortTMⅠ.The expression of SGK3 in transfected cells was identified by Western blotting.The effect of SGK3 over expression on cell clonal proliferation was observed by colony formation assay.The changes of cell invasion ability were observed by Transwell invasion assay.The expression of tumor metastasis related genes was detected by Western blotting.Results The expression of SGK3 in breast invasive ductal carcinoma was significantly higher than that in normal breast tissues and breast fibroadenoma(P<0.05).The colony formation and the invasion ability were increased in SGK3 overexpression MDA-MB-231cells(P<0.01).Overexpression of SGK3 increased the expression of MMP2 and MMP9 but not effected the expression of breast cancer metastasis suppressor 1 (BRMS1) in MDA-MB-231 cells by Western blotting.Conclusion SGK3 was highly expressed in breast invasive ductal carcinoma tissues,overexpression of SGK3 promote invasion of breast cancer cells in vitro by increasing the expression of tumor metastasis related genes MMP2 and MMP9.

SGK3;breast cancer;invasion;MMP2;MMP9

黑龍江省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201511230010)

1007-4287(2016)12-1990-05

R737.9;R34

A

2016-05-18)

*通訊作者