HepG2細胞胰島素抵抗模型建立及鹽酸小檗堿改善胰島素抵抗的實驗研究

龔 菂，李 芬，鄒 欣，王定坤，陸付耳，王開富

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院 1.中西醫結合研究所、2.實驗醫學研究中心，湖北 武漢 430030)

HepG2細胞胰島素抵抗模型建立及鹽酸小檗堿改善胰島素抵抗的實驗研究

龔 菂1，李 芬2，鄒 欣1，王定坤1，陸付耳1，王開富1

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院 1.中西醫結合研究所、2.實驗醫學研究中心，湖北 武漢 430030)

目的 建立HepG2(人肝胚胎瘤細胞)胰島素抵抗(insulin resistance，IR)細胞模型，并在該模型上研究小檗堿改善IR的效應。方法 用25 mmol·L-1高糖，并分別用10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol·L-1胰島素處理，誘導HepG2細胞產生IR；對2-NBDG(熒光素標記葡萄糖)與HepG2細胞孵育濃度設定為：50、100、200、400、600、800 μmol·L-1、孵育時間設定為：20、40、60、80、100 min，擬篩選最佳胰島素處理濃度、2-NBDG與HepG2最佳孵育濃度和最佳孵育時間，通過檢測細胞培養液中葡萄糖的消耗量及細胞對葡萄糖的攝取量作為判定模型成功的標志；用二甲雙胍、鹽酸小檗堿干預模型細胞，研究鹽酸小檗堿在細胞水平上改善IR的效應。結果 6種濃度的胰島素均可不同程度誘導HepG2產生IR，雖然10-5、10-4mol·L-1劑量最明顯，但細胞死亡較多，以10-6mol·L-1劑量制模有效且細胞成活率高，與正常組比較差異具有統計學意義；當2-NBDG與HepG2細胞孵育濃度大于100 μmol·L-1時，細胞熒光強度與正常組差異有顯著性，孵育時間超過20 min熒光強度與正常組比較有明顯差異，超過100 min，細胞內熒光有明顯淬滅衰減現象；鹽酸小檗堿、二甲雙胍能明顯增加細胞培養上清液中葡萄糖的消耗及細胞對葡萄糖的攝取，與模型組比較差異具有統計學意義。結論 用HepG2制作IR細胞模型時，選擇10-6mol·L-1劑量的胰島素；2-NBDG孵育濃度選擇為200 μmol·L-1、2-NBDG孵育時間選擇為80min較為適宜，鹽酸小檗堿及二甲雙胍對HepG2細胞IR具有明顯的改善作用。

鹽酸小檗堿，HepG2細胞，胰島素抵抗，細胞模型；葡萄糖攝取；實驗研究

目前認為胰島素抵抗(insulin resistance，IR)不僅是2型糖尿病的發病基礎，也是貫穿多種代謝相關疾病的主線，是心血管疾病、高脂血癥、高尿酸血癥及代謝綜合癥的共同病理基礎[1-2]。構建胰島素抵抗細胞模型是進行IR相關疾病的病理機制探索及藥物研發的重要途徑。肝臟及外周組織是胰島素作用的靶器官，是IR產生的主要部位。HepG2細胞源于人的肝胚胎瘤細胞，系一種表型與肝細胞極為相似的肝胚胎瘤細胞株，在高水平的胰島素條件下，HepG2細胞表面胰島素受體的數目下降，下降程度與胰島素水平及刺激持續的時間呈正相關[3]，因此 HepG2是體外研究胰島素抵抗發病機制和降糖藥物作用機制的理想細胞模型[4]，鑒于目前許多報道有關HepG2 細胞體外建立胰島素抵抗的實驗條件均不太一致，特別是過去觀察細胞成模只是單從細胞上清葡萄糖的消耗量來反映，有很大局限性，因此，我們對該細胞的制模條件、尤其是利用熒光標記葡萄糖-2-NBDG摻入到細胞內，對HepG2 細胞攝取葡萄糖的相關實驗及小檗堿改善HepG2 細胞IR效應進行了系列研究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 DMEM高糖培養基購自Hyclone；胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；2-NBDG(熒光標記葡萄糖)購置Cayman Chemical公司；胰島素購置Sigma公司；鹽酸小檗堿(批號：110713-200208，純度：99.0%)購自中國藥品生物制品檢定所；二甲雙胍(批號：EJ121231，純度：98.5%)購自天津太平洋化學制藥有限公司。葡萄糖測試試劑盒購置南京建成生物工程研究所。

1.2 HepG2細胞培養 HepG2消化后，以每孔1.5×104種到96孔板內(完全培養基)，吸去原培養基，加入無血清培養基，饑餓10 h。加不同濃度：0(不加胰島素)、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol·L-1胰島素處理36 h(母液用無血清培養基稀釋)，吸去胰島素，PBS清洗2次，加入無血清培養基，孵育24h，用葡萄糖氧化酶法，于505 nm處以酶標儀分別檢測用胰島素處理的各孔細胞培養上清液及未接種細胞的空白孔(含糖量已知的培養液) OD值，與葡萄糖的標準濃度計算每孔培養液中葡萄糖的含量，并用未接種細胞的空白孔糖含量均值相減，計算葡萄糖的消耗量。

計算方法：待測液葡萄糖含量/mmol·L-1=(待測液OD值/標準液OD值)×5.55 mmol·L-1

葡萄糖消耗量/mmol·L-1=空白孔糖含量均值-每孔細胞培養上清液糖含量

1.3 HepG2細胞與2-NBDG孵育時間 通過對細胞上清葡萄糖消耗量的檢測初步篩選胰島素最佳制模劑量為10-6mol·L-1，細胞成模后再用2-NBDG與HepG2細胞分別孵育20、40、60、80、100 min檢測細胞上清葡萄糖消耗量及細胞對2-NBDG(熒光強度)攝取量，計算對照組與模型組的差值，篩選最佳孵育時間。

1.4 HepG2細胞與2-NBDG孵育濃度 通過對細胞上清葡萄糖消耗量的檢測初步篩選胰島素最佳制模劑量為10-6mol·L-1，細胞成模后再分別設定50、100、200、400、600、800 μmol·L-12-NBDG劑量與HepG2細胞共孵育60 min后，檢測細胞上清葡萄糖消耗量及細胞對2-NBDG(熒光強度)攝取量，計算對照組與模型組的差值，確定2-NBDG最佳濃度。

1.5 熒光葡萄糖的攝取 將細胞種置于特殊的96孔板，黑板子底部透明，每孔1.5×104個細胞，用上述方法造模后，棄去培養液，PBS洗板2次，加入二甲雙胍(終濃度為25 μmol·L-1)、鹽酸小檗堿(終濃度為10 μmol·L-1)干預胰島素抵抗的HepG2細胞，孵育24 h后收集培養上清液，用葡萄糖氧化酶方法檢測上清液中葡萄糖的含量，PBS洗板2次，避光加入200 μmol·L-1的2-NBDG 37 ℃孵育1 h后棄去2-NBDG，用預冷的PBS洗2次，加入100 μL的PBS(整個過程避光)，快速在酶標儀下，在460 nm 激發光、528 nm發射光，儀器靈敏度為50的條件下檢測熒光強度，計算對照組及給藥組細胞的葡萄糖消耗量及細胞對葡萄糖的攝取量。

2 結果

2.1 不同濃度的胰島素對制模的影響 如Tab 1所示，6種濃度的胰島素均可不同程度的誘導HepG2產生IR，但10-6mol·L-1劑量最適宜，其細胞培養上清中葡萄糖消耗明顯增多且細胞成活率高，與正常對照組比較差異具有統計學意義。

2.2 HepG2細胞與2-NBDG孵育時間 由Fig 1可見，當孵育時間>20 min以上，各時間組HepG2細胞對葡萄糖的攝取均明顯增多，顯示熒光強度明顯強于NC組(P<0.05)；于80 min攝取的葡萄糖最多，與NC組比較差異具有顯著性(P<0.01)，結果表明HepG2細胞與2-NBDG孵育時間以80 min較為適宜。

Tab 1 Effect of different concentrations of insulin on model

GroupInsulinconcentration(mmol·L-1)Glucoseconsumption(mmol·L-1)Normalcontrol05.771±0.22210-95.005±0.28310-85.316±0.161Model10-73.712±0.368*10-62.059±0.166*10-51.954±0.215**10-41.543±0.145**

*P<0.05;**P<0.01vsnormal control group (without insulin group)

Fig 1 Effect of different incubating time of 2-NBDG on fluorescence intensity

NC：Normal control；20-100： Different time set,*P<0.05,**P<0.01vsNC

2.3 HepG2細胞與2-NBDG孵育濃度 Fig 2顯示，當孵育濃度>100 μmol·L-1以上，各濃度組HepG2細胞對葡萄糖的攝取均明顯增多，顯示熒光強度明顯強于NC組(P<0.05，P<0.01)，且孵育濃度與熒光強度具有明顯的量效關系。

2.4 鹽酸小檗堿對IR的HepG2細胞培養上清葡萄糖消耗的影響 如Tab 2所示，用鹽酸小檗堿、二甲雙胍分別對胰島素抵抗的HepG2細胞進行干預后，發現兩種藥物均能促進細胞培養上清中葡萄糖的消耗，與模型組比較葡萄糖消耗量明顯增多(P<0.05)。

2.5 鹽酸小檗堿對IR的HepG2細胞內攝取葡萄 糖的影響 Fig 3顯示，當鹽酸小檗堿、二甲雙胍組(西藥陰性對照組)干預IR的HepG2細胞后，兩組均能明顯促進細胞對葡萄糖的攝取，顯示細胞內熒光強度明顯高于模型組(P<0.01)；Fig 4顯示，在熒光顯微鏡下(×200)觀察進入到細胞內的2-NBDG，可見鹽酸小檗堿及二甲雙胍兩組細胞內2-NBDG明顯增多，熒光強度明顯高于模型組。

Fig 2 Effect of different concentrations of 2-NBDG on fluorescence intensity

NC：Normal control ；50～800：Different concentration groups.*P<0.05,**P<0.01vsNC.

Tab 2 Effect of berberine hydrochloride on glucose

GroupDrugdose/μmol·L-1Glucoseconsumption/mmol·L-1Normalcontrol25.33±0.77Modelgroup11.95±1.94**Berberinehydrochloride1016.85±0.33*#Metformingroup25016.27±1.09*#

*P<0.05，**P<0.01vsnormal control group；#P<0.05vsmodel group

Fig 3 Effect of berberine hydrochloride on 2-NBDG uptake in HepG2 cells

M:Model group，BBR：Berberine hydrochloride; MET：Metformin group.**P<0.01vsmodel.

3 討論

體外建立胰島素抵抗細胞模型既能在細胞及分子水平深入探討胰島素抵抗的發生機制，又可體外篩選防治胰島素抵抗的藥物，因此建立穩定可靠的細胞模型至關重要，HepG2 細胞源于人的肝胚胎瘤細胞，是目前國內外應用較廣泛的研究胰島素抵抗機制的細胞模型。我們圍繞細胞模型制作條件及鹽酸小檗堿抗胰島素抵抗的效應進行了系列研究，實驗結果顯示，不同濃度胰島素刺激HepG2細胞均可不同程度誘導產生胰島素抵抗,并表現為明顯的量效關系，用10-5、10-4mol·L-1劑量的胰島素刺激細胞能使細胞培養上清中葡萄糖消耗量明顯減少，表明胰島素抵抗明顯，但MTT檢測細胞時發現細胞死亡增多，可能是太高濃度的胰島素使細胞的生長狀態、生長活力有所降低，因此，該劑量制模不可取；用10-8、10-9mol·L-1濃度刺激細胞，雖然細胞存 活率高，但細胞培養上清中葡萄糖消耗量與正常對照組比較差異無顯著性，表明胰島素抵抗不明顯，故以10-6mol·L-1誘導的胰島素抵抗模型效果最佳。許多文獻報道[5-6]判定胰島素抵抗細胞模型成功與否，僅單從細胞培養上清葡萄糖消耗量來反映具有很大的局限性，也有人用同位素標記葡萄糖來監測細胞對葡萄糖的攝取量而反映胰島素抵抗情況[7]，方法雖靈敏可靠，但鑒于同位素對人體的傷害，導致目前國內幾乎不生產同位素標記的葡萄糖試劑盒，取而代之的是新型的熒光素標記的葡萄糖-2-NBDG，這種試劑盒可以通過對細胞內熒光強度的檢測來反映細胞對葡萄糖攝取量。因此本研究采用兩種方法即同時檢測細胞培養上清葡萄糖消耗量及細胞對2-NBDG攝取量來反映胰島素抵抗的模型成功與否，更精細更完善。細胞與2-NBDG的孵育時間和孵育濃度是整個實驗的關鍵，本研究結果顯示：當孵育時間>20 min以上時，各時間組HepG2細胞對葡萄糖的攝取均明顯增多，細胞內熒光強度明顯強于NC組(P<0.05)，表明細胞攝取的葡萄糖多，于80min攝取的葡萄糖最多，與NC組比較差異有顯著性(P<0.01)，結果表明HepG2細胞與2-NBDG孵育時間以80 min較為適宜；當孵育濃度>100 μmol·L-1以上時，各濃度組HepG2細胞對葡萄糖的攝取均明顯增多，顯示熒光強度明顯高于NC組(P<0.05，P<0.01)，且孵育濃度與熒光強度具有明顯的量效關系。因此認為HepG2細胞與2-NBDG孵育濃度以200 μmol·L-1即可(考慮2-NBDG試藥成本而不選用高劑量2-NBDG濃度)。

Fig 4 2-NBDG in cells under fluorescence miroscope(×200)

A: Model set B：Berberine hydrochloride(Drug dose：10 μmol·L-1) C：Metformin group(Drug dose：250 μmol·L-1)

鹽酸小檗堿是一種常見的異哇琳生物堿，作為中草藥其常用于治療炎癥、細菌相關性腹瀉、腸道寄生蟲感染等，除抗炎作用外，近來有關鹽酸小檗堿改善胰島素抵抗的報道相繼增多[8-9]。本研究發現，在HepG2細胞胰島素抵抗模型成功建立的基礎上用鹽酸小檗堿和二甲雙胍干預細胞后，兩種藥物均能使細胞培養上清中葡萄糖的消耗量明顯增多、細胞內熒光強度也明顯增強，與模型組比較差異具有顯著性(P<0.01)，而兩組藥物間差異無統計學意義(P>0.05),熒光顯微鏡下觀察也發現HepG2細胞對2-NBDG攝取明顯增多(Fig 5)，與熒光強度檢測結果十分吻合，該結果表明鹽酸小檗堿和二甲雙胍均能明顯改善高糖加胰島素誘導的HepG2細胞胰島素抵抗。近年來，小檗堿抗糖尿病已成為研究熱點[10-12]但其作用機制尚未完全闡明。磷脂酰肌醇3激酶(PI-3K)途徑是胰島素信號轉導的主要通路之一，研究表明，胰島素刺激包括脂肪和骨骼肌在內的靶組織攝取利用葡萄糖是通過胰島素受體(InsR)、胰島素受體底物-1(IRS-1)、PI-3K葡萄糖轉運蛋白4 (GLUT4)等一系列信號轉導過程完成的[13]。在PI-3K途徑中，當胰島素與靶細胞表面的受體(InsR)結合，InsR即發生自身磷酸化并激活內在的酪氨酸激酶，導致IRS-1等酪氨酸殘基磷酸化，磷酸化的IRS-1與PI-3K的p85調節亞單位結合，催化p110而激活PI-3K，活化的PI-3K可加速GLUT4從胞內易位至胞膜，調節肌細胞、脂肪細胞和肝細胞對葡萄糖的攝取[14]。這一信號轉導過程的任何環節障礙均可引起胰島素抵抗。對于體外的胰島素抵抗細胞模型,鹽酸小檗堿可能主要通過胰島素信號轉導途徑來改善胰島素的生物效應,提高細胞對葡萄糖的吸收。本實驗結果表明小檗堿可能以胰島素增敏劑的形式促進細胞對葡萄糖的消耗而改善HepG2細胞的胰島素抵抗，但它促進細胞葡萄糖消耗或細胞對葡萄糖攝取的機制將在后期進一步的研究報道。

[1] Sowers J R,Frohlich ED. Insulin and insulin resistance impact on bloodpressure and cardiovascular disease[J].MedClinNorthAm,2004,88(1):63-821.

[2] Valeria L Z,Monika Z B. Insulin resistance in hypertension and cardio-vascular disease[J].BestPractice&Research,2006,20(3):355-3671.

[3] Levy J R，Belsky M． Down-regulated insulin receptors in HepG2 cells have an altered intracellular itinerary[J]．AmJMedSci， 1990,299(5):302-308.

[4] Dhananjay G，Shailly V，Ramji L K． Long-term effects of tumor necrosis factor-α treatment on insulin sigalling pathway in HepG2 cells and HepG2 cells overexpressing constitutively active Akt/PKB[J].JCellBiochem，2007,100(3):593-607.

[5] 方 飛，吳新榮，羅明俐，呂 歡. HepG2細胞胰島素抵抗模型的建立及在篩選桑葉有效部位中的應用[J]. 醫藥導報， 2012,31(6):691-4.

[5] Fang F, Wu X R, Luo M L, et al. Establishment of insulin resistance HepG2 cell model and its application in screening bioactive compoments of mulberry leaves[J].HeraldMed, 2012,31(6):691-4.

[6] 李秀麗，賀嵩敏，朱 瑩,等. HepG2 細胞胰島素抵抗模型的建立與鑒定[J]. 中國實驗方劑學雜志， 2013,19(5):203-6.

[6] Li X L, He S M, Zhu Y, et al. Establishment and identify of HepG2 cells model of insulin resistance[J].ChinJExpTraditMedForm, 2013,19(5): 203-6.

[7] 易 屏，陸付耳，陳 廣，等. 小檗堿抑制IKKBSer 181磷酸化改善高糖誘導的3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗的分子機制[J]. 中草藥， 2008,39(5):724-8.

[7] Yi P, Lu F E, Chen G, et al. Molecular mechanism of berberine on improving insulin resistance of 3T3-L1 adipocytes induced by high glucose through IKKβ Ser 181 phosphorylation[J].ChinTraditHerbalDrugs, 2008,39(5):724-8.

[8] 丁陽平，葉小利，周 潔，等. 小檗堿降糖作用機制研究進展[J]. 中草藥，2013，44(6)：763-9.

[8] Ding Y P,Ye X L,Zhou J, et al. Research progress in hypoglycemic mechanism of bererbine[J].ChinTraditHerbalDrugs, 2013,44(6):763-9.

[9] 陳 廣，陸付耳，王增四，等. 小檗堿改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗與PI-3K、GLUT4蛋白相關性的研究[J]. 中國藥理學通報， 2008,24(8):1007-10.

[9] Chen G, Lu F E,Wang Z S, et al. Study on the improvement of berberine in type 2 diabetic rats with insulin resistance and the relationship between PI-3K and GLUT4 protein correlation[J].ChinPharmacolBull, 2008,24(8):1007-10.

[10]李 穎，李健琳，范 晨，等. 小檗堿片對2型糖尿病患者胰島素分泌及抵抗的影響[J]. 現代診斷與治療， 2015,26(7):1450-1.

[10]Li Y , Li J L, Fan C, et al. Berberine tablets in patients with type 2 diabetes insulin secretion and the influence of the resistance[J].ModernDiagnTreat, 2015,(267):1450-1.

[11]張 青，李 琰，陳 磊. 黃連素對 2 型糖尿病及其并發癥的治療作用及相關機制研究進展[J]. 中國中藥雜志， 2015,40(9):1660-5.

[11]Zhang Q, Li Y, Chen L, et al. Effect of berberine in treating type 2 diabetes mellitus and complications and its relevant mechanisms[J].ChinJChinMaterMed, 2015,40(9):1660-5.

[12]馬 航,胡慭然,鄒宗堯,等.黃連生物堿降糖作用研究及構效關系初探[J]. 中國藥理學通報,2015,31(11):1575-9.

[12]Ma H,Hu Y R,Zou Z Y,et al. Preliminary evaluation of antihyperglycemic effect of Rhizoma Coptidis alkaloids and their structure-activity relationships[J].ChinPharmacolBull,2015,31(11):1575-9.

[13]Wojtaszewski J F P,Hansen B F,Kien B, et a.l Insulin signaling in human skeletalmuscle: time course and effectof exercise[J].DiaBetes, 1997,46(11): 1775-81.

[14]Jackson S, Bagstaff S, Yeasman S J, et a.l Decreased insulin re-sponsiveness ofglucose uptake in cultured human skeletalmuscle cells from insulin-resistantnondiabetic relatives ofType 2 diabetic families[J].Diabetes， 2000,49(7): 1169-77.

HepG2 cell IR： Establishment of model and improvement by berberine

GONG Di1, LI Fen2， ZOU Xin1， WANG Ding-kun1LU Fu-er1,WANG Kai-fu1

(1.InsitituteofIntegratedTraqditionalChineseandWesternMedicine, 2.ExperimentMedicalResearchCenter,TongjiHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollegeHuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China)

Aim To establish insulin resistance cell model on HepG2 cells (human embryonic liver tumor cells ) and investigate the effect of berberine hydrochloride on insulin-resistant HepG2 (IR-HepG2) cells. Methods ① IR model was induced by respectively using 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5, 10-4mol·L-1insulin with 25 mmol·L-1glucose in HepG2 cells. ② HepG2 cells were incubated with 2-NBDG (fluorescent labeled glucose) in a series of concentration: 50, 100, 200, 400, 600, 800 μmol·L-1and a series of incubation time: 20, 40, 60, 80, 100 min, to select the optimum concentration of insulin and the optimum incubation concentration and time of 2-NBDG in HepG2 cells. The success of the model was determined by detecting the consumption of glucose in the cell supernatant and the uptake of glucose in HepG2 cells. ③ To study the effect of berberine hydrochloride on improving insulin resistance on the cell level, metformin and berberine hydrochloride were used in the IR cells. Results Six concentrations of insulin induced the IR model in different degrees. Although 10-4, 10-5mol·L-1insulin was significant, a large amount of cells died. 10-6mol·L-1insulin was effective and had high survival rate of HepG2 cells, which had statistical significance compared with the normal group. When the incubation concentration of 2-NBDG was more than 100 mol·L-1, the fluorescence intensity of the cells was significantly different from the normal group. When the incubation time of 2-NBDG was more than 20 min, fluorescence intensity was significantly different from the normal group. When the incubation time of 2-NBDG was more than 100 min, the fluorescence quenching phenomenon was obvious in the cells. Berberine hydrochloride and metformin significantly increased the glucose consumption and glucose uptake in cell supernatant, which had statistical significance compared with the model group. Conclusions Using 10-6mol·L-1insulin induced IR model in HepG2 cells, the optimum incubation concentration and incubation time of 2-NBDG is 200 μmol·L-1and 80 min, respectively. Berberine hydrochloride and metformin have obvious effect on improving IR in HepG2 cells.

berberine hydrochloride; HepG2 cells; insulin resistance; the cell model; glucose uptake; experimentel research

時間：2016-12-5 15:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.044.html

2016-07-05，

2016-09-10

國家自然科學基金資助項目(No 81373872)

龔 菂(1984-)，女，檢驗師,E-mail:27770583@qq.com; 王開富(1958-)，男，碩士，主任技師，通訊作者，Tel:027-83663660,E-mail:wkf58@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.022

A

1001-1978(2016)12-1750-05

R284.1；R343.23；R347.8；R458.5；R587.1；R915；R977.15；R977.7