基于新一代測序技術對犬肛周腺腫瘤差異表達基因分析

胡 平 ， 郭澤領 ， 林德貴

(1.中國農業大學動物醫學院， 北京海淀100193 ； 2.北京農業職業學院， 北京房山102442 ；3.北京觀賞動物醫院， 北京西城100190)

基于新一代測序技術對犬肛周腺腫瘤差異表達基因分析

胡 平1, 2， 郭澤領1, 3， 林德貴1

(1.中國農業大學動物醫學院， 北京海淀100193 ； 2.北京農業職業學院， 北京房山102442 ；3.北京觀賞動物醫院， 北京西城100190)

犬肛周腺腫瘤(Hepatoid gland tumours)高發于未去勢老年公犬， 在雄性犬的腫瘤中發病率排名第三。 本研究采用IlluminaHiSeqTM2500高通量轉錄組RNA-seq測序技術對犬肛周腺腫瘤的組織和正常肛周腺組織分別進行測序。 發現差異表達基因588個， 其中上調基因23個， 下調基因565個， 差異極顯著水平的基因94個。 通過對GO基因功能聚類， 發現生物過程類別基因37個、 分子功能類別24個。 KEGG分析發現有 470個基因涉及信號通路262個。

犬肛周腺腫瘤， 轉錄組， Illumina測序， 新一代測序

犬肛周腺腫瘤是老年雄性犬高發的一種皮膚腫瘤[1]。肛周腺組織僅存在于犬科動物和有袋類動物(如袋鼠)[2]。國外曾報道該腫瘤在犬的肛門周圍發生的腫瘤中發病率可達80%以上，在雄性犬的腫瘤發病率中排名第三[4]。本試驗借助新一代測序方法對比腫瘤與正常組織的差異基因，探索犬肛周腺腫瘤發生發展的機制，為肛周腺腫瘤的分子標記物研究提供有益數據[6]。

1 材料與方法

1.1 組織樣本采集 2011年1月—2013年12月北京觀賞動物醫院就診的肛周腺腫瘤患犬10例，老年雄性犬的正常肛周腺組織6例，摘除手術均在無菌手術室中進行，樣本分別在同期實驗制成石蠟組織切片和液氮保存。經H.E.染色進行組織病理學觀察，證實為犬肛周腺瘤或正常肛周腺組織。在液氮中保存的10例肛周腺腫瘤隨機分為2組，6例正常犬肛周組織1組，用于RNA提取。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取和測序文庫的建立 將10例肛周腺腫瘤組織隨機分為2組，每組5個樣本。6個正常肛周腺組織作為正常對照組。按照TRIZol Reagent試劑盒操作說明書提取10個肛周腺腫瘤組織和6個對應正常肛周腺組織的總RNA。將兩個肛周腺腫瘤組樣本和正常肛周腺組織樣本的總RNA進行混合，構建2個腫瘤轉錄組文庫和1個正常肛周腺組織轉錄組文庫，每個文庫至少3G數據，三個文庫至少9G數據。

1.2.2 測序與數據處理 本實驗由北京百歐美生物科技有限公司采用Illumina HiSeqTM2500高通量測序技術，利用雙末端(Paired-End)測序法對肛周腺瘤組織文庫進行轉錄組測序。利用Fastqc軟件對取得的reads數據進行數據檢測和評估。利用tophat(2.0.9版本)軟件[7]及bowtie2(2.1.0)軟件[8]將犬肛周腺的clean data mapping家犬(Canis lupus familiaris)的基因組中，對測序結果進行比對和注釋。

1.2.3 差異表達基因GO和KEGG富集分析 我們利用GOseqR軟件包[9]進行差異基因的GO富集分析；并使用Wego[10]繪制 GO 注釋結果。對于實驗組中的兩樣品間，將差異基因作為前景，全部基因作為背景，進行KEGG的富集分析，使用超幾何分布(phyper)計算前景基因，同Pathway分類中某個特定分支的P值，并用FDR進行校正。

2 結果與分析

2.1 基因表達及差異分析 通過對RNA-seq的數據結果，分析篩選得到了肛周腺腫瘤組和正常組的之間的轉錄本差異表達基因，以及轉錄本異構體的表達分布和表達差異情況(Fold changed≥2，p value≤0.001)(如中插彩版圖1)。

統計結果發現，腫瘤組于對照組差異表達基因共有588個，其中上調基因23個，下調基因有565個，其中達到極顯著水平基因(FC≥2，FDR<0.05)有94個。而轉錄異構體isoforms中差異轉錄本有827個，其中上調基因24個，下調基因803個。上調的23個基因包含了已經注釋的編碼基因3類基因即LYZF2、MMP-1、Ig免疫球蛋白λ鏈六區類似基因。還有10個注釋的非編碼小RNA分子即轉運tRNA。此外，還發現4個功能未知的新轉錄。下調基因中，包括未注釋基因，核糖體蛋白，非編碼RNA(ncRNA)以及抗體Ig和翻譯延伸因子類型。這些類型存在許多可能是新型的轉錄本，比例最高，占45%。其次是核糖體蛋白，占28%。再次是ncRNA，占17%，另外一些翻譯延伸因子占6%。按照表達量篩選出上下調最顯著的前10個基因(如表1、2)。

表1 RNA-seq中犬肛周腺腫瘤組織中相對正常對照上調的前10個基因列表

表2 RNA-seq中犬肛周腺腫瘤組織中相對正常對照下調的前10位個基因

2.2 差異基因表達基因GO及KEGG富集分析 GO分析表明，共有120個基因得到歸類注釋，涉及生物過程、細胞組成及分子功能三大類共20個小類。細胞組成大類中涉及10個小類共59個基因，其中cell和cell prat小類所占比例最多包括33個基因，占所有表達基因的10.8%，其次是organelle類別，有8個基因占表達基因總數的2.6%。在生物過程大類中涉及14個小類37個基因，其中細胞過程類別最多出現6個基因占2%，其次是刺激應答反應類別有5個基因，占1.7%。在分子功能大類中涉及3個小類共24個基因，其中binding有14個基因占表達基因總數的4.6%。

KEGG分析表明，共有470個基因涉及262個通路，其中代謝途徑通路涉及的基因數目最多，有16個基因，其次為嗅覺途徑通路有12個、代謝通路涉及8個，以及癌癥信號通路、信號轉導通路、PI3K-Akt各涉及7個基因，此外免疫系統途徑及MAPK和Proteoglycans in cancer途徑各6個基因，細胞因子受體途徑5個基因等。

3 討論

本實驗借助Illumina 2500測序平臺對犬肛周腺腫瘤的轉錄組進行測序，發現了一些重要的與癌癥相關的基因變化。生物信息研究發現這些基因主要與免疫反應、刺激響應、細胞粘著以及運動和發育等功能有關，這些通路都離不開細胞表面受體和細胞核中轉錄因子的參與。

3.1 測序技術對犬肛周腺腫瘤與正常犬肛周腺組織分析差異表達基因共有588個，其中上調基因23個，下調基因565個。這些基因中差異極顯著的基因有94個，其中下調基因中還包括為一些尚未注釋的ncRNA，揭示出這些基因很可能是尚未發現的抑癌基因。

3.2 通過KEGG代謝通路分析，發現有470個基因涉及260個信號通路，發現在這些通路中顯著變化的基因如：MMP-1(基質金屬蛋白酶-1)、FGF7(成纖維細胞生長因子7)、GST(谷胱甘肽轉移酶)、ECM(細胞外基質)等基因可能與犬肛周腺腫瘤的發生、發展具有密切關系。

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Study on Differentially Expressed Gens betweenHepatoid gland and its tumors Based on Transcriptomes with High-throuphput RNA-seq Technology

HU Ping1, 2, GUO Ze-ling1, 3, LIN De-gui1

(1. College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China; 2. Beijing Vocational College of Agricultural, Beijing 102442, China; 3. Beijing Guanshang Animal hospital, Beijing 100190, China)

Perianal gland tumor ranks the top 3 among all types of canine tumor types in male dogs. This study employed the high-throughout sequencing technology to analyze the difference of gene expressions between perianal gland tumors and normal perianal gland tissue for the first time. The results showed that there were 588 different lially expressed genes between the tumors experimental group and the control group, including 23 up-regulated genes and 565 down-regulated genes，and the genes with significant difference were 94. Based on GO clustering analysis， the Biological Process cluster included 37 genes and the Molecular Function cluster included 24 genes. KEGG analysis found that 470 genes were involved in 262 signal pathways.

Hepatoid gland tumours ； transcriptome ； Illumina sequencing ； Next-Generation and Sequencing

LIN De-gui

2016-06-01

胡平(1975- )，女，獸醫師，博士生，從事小動物臨床及動物病理教學工作，E-mail:hpwisdom@163.com

林德貴， E-mail： csamalin@sina.com

S858.292

A

0529-6005(2016)11-0023-03