不同乳汁成分乙型肝炎病毒DNA定量檢測的結果分析*

汪東劍，余維濤，劉冬萍，張曉云，邱華琴，劉 仙

(中國人民解放軍第一八四醫院輸血科，江西鷹潭 335000)

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·論 著·

不同乳汁成分乙型肝炎病毒DNA定量檢測的結果分析*

汪東劍，余維濤Δ，劉冬萍，張曉云，邱華琴，劉 仙

(中國人民解放軍第一八四醫院輸血科，江西鷹潭 335000)

目的 分析不同乳汁成分中乙型肝炎病毒(HBV)-DNA定量檢測的結果，為乳汁標本HBV-DNA檢測提供參考和依據。方法 對152例乙肝產婦乳汁分別選用混勻乳汁、乳酪、乳清和沉淀進行HBV-DNA定量檢測。結果 選用不同的檢測對象時，HBV-DNA檢測的陽性率差異無統計學意義(χ2=0.437，P=0.933)；HBV-DNA載量間差異有統計學意義(F=2.835，P=0.043)，沉淀中HBV-DNA載量高于乳清中HBV-DNA載量；兩兩比較后，混勻乳汁、乳酪、乳清間檢測結果差異無統計學意義(P>0.05)，混勻乳汁、乳酪、沉淀間檢測結果差異無統計學意義(P>0.05)。結論 對乳汁標本進行HBV-DNA定量檢測時，混勻乳汁可能是更為適合的檢測對象。

乳汁； 乙型肝炎病毒； DNA

乙型肝炎病毒(HBV)可以通過血液、唾液、乳汁等傳播，母嬰傳播是HBV傳播的重要途徑。利用血清HBV-DNA定量檢測體系對乳汁標本HBV-DNA進行檢測已經廣泛用于臨床和試驗研究[1-3]。乳汁是一種較為特殊的體液，經過自然沉淀或離心后形成以乳酪、乳清和沉淀為主的3種成分，在乳汁HBV-DNA檢測中，不同的學者所選取乳汁成分各不相同，多以乳清或者沉淀為對象進行檢測[4-6]。目前尚少見使用不同乳汁成分進行HBV-DNA檢測結果一致性方面的報道，故對于不同學者間的研究成果是否具有可比性存在疑慮。作者在將高載量HBV-DNA陽性定值血清摻入陰性乳汁建立的自制HBV-DNA陽性乳汁模型中發現，同一樣品不同乳汁成分中檢測出的HBV-DNA載量并不一致[7]。由于該模型中HBV-DNA是外來摻入乳汁中，與真實乳汁中HBV-DNA的存在形式和分布情況可能存在差異，為此本文對152例產婦乳汁標本選用不同成分作為研究對象進行HBV-DNA定量檢測，通過比較和分析檢測結果，試圖發現不同乳汁成分HBV-DNA檢測規律，為臨床和科研工作中選用適當的乳汁成分進行HBV-DNA檢測提供依據和參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年10月至2015年12月于本院婦產科分娩，根據2000年全國病毒性肝炎學術會議修訂的《病毒肝炎防治方案》診斷標準確診的152例乙肝產婦，年齡18～39歲，平均(26.07±4.81)歲。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及處理 產后待初乳分泌后，無菌操作采集3～4 mL乳汁于無菌干燥試管密封后-20 ℃保存待檢。

1.2.2 乳汁不同成分的HBV-DNA檢測 將收集到的待檢乳汁標本按檢測對象不同分為混勻乳汁組、乳酪組、乳清組、沉淀組，各組HBV-DNA載量檢測按以下方法進行：(1)以混勻乳汁作為檢測對象：將乳汁標本充分混勻后，取乳汁200 μL，加入450 μL DNA提取液和4 μL內標溶液，震蕩混勻15 s，瞬時離心數秒后，于100 ℃干式恒溫器處理10 min，12 000 r/min離心5 min備用；取上清液20 μL加入HBV-PCR反應管12 000 r/min離心數秒后上機擴增。(2)以乳酪、乳清、沉淀作為檢測對象：將乳汁標本3 000 r/min離心10 min，分別取乳酪層、中間乳清層、底部沉淀各200 μL，加入450 μL DNA提取液和4 μL內標溶液，震蕩混勻15 s，瞬時離心數秒后，于100 ℃干式恒溫器處理10 min；12 000 r/min離心5 min備用；取上清液20 μL加入HBV-PCR反應管12 000 r/min離心數秒后上機擴增。(3)結果分析按試劑盒操作說明書進行。

1.3 儀器與試劑 HBV-DNA核酸定量檢測使用中山大學達安基因股份有限公司生產的DA-7600核酸擴增儀及其配套HBV-DNA核酸定量檢測試劑盒。

2 結 果

2.1 不同乳汁成分HBV-DNA檢測結果 152例乙肝產婦乳汁HBV-DNA檢測陽性率見表1，不同乳汁成分HBV-DNA檢測陽性率間差異無統計學意義(χ2=0.437，P=0.933)。所有乳汁成分HBV-DNA檢測均為陽性者共22例，其不同成分HBV-DNA載量檢測結果見表1。對4種乳汁成分HBV-DNA載量結果進行方差檢驗，結果顯示4種乳汁成分中HBV-DNA檢測結果間差異有統計學意義(F=2.835，P=0.043)。

表1 乳汁不同成分HBV-DNA檢測結果

注：*表示所有成分HBV-DNA檢測均為陽性的22例乳汁標本。

2.2 乳汁HBV-DNA載量分布情況 乳汁標本中，不同成分HBV-DNA載量分布情況見表2，比較不同乳汁成分中HBV-DNA載量的分布情況發現，差異無統計學意義(χ2=8.499，P=0.204)。

表2 乳汁HBV-DNA載量分布情況[n(%)]

3 討 論

由于HBV-DNA定量檢測試劑盒說明書中，并未對乳汁標本的檢測事項進行說明，雖然在《實時熒光PCR技術》中對于乳汁中布魯菌和分枝桿菌DNA的提取分別選用乳汁整體和重懸后的沉淀作為對象[8]，但也未明確乳汁中HBV-DNA的提取方法，這使得多數學者在對乳汁標本進行HBV-DNA檢測時，對選擇檢測對象缺乏有效的參考，也有不少學者嘗試對乳汁標本進行前處理使其更適用于血清HBV-DNA檢測體系[9-10]。乳汁分泌后作為一種渾濁非勻質液體，需要檢測的是能代表其整體的HBV-DNA載量，本文之所以對乳汁進行離心選用乳清或者沉淀作為檢測對象，多數是基于提高檢測的準確性和陽性率的考慮。

在本研究中，使用混勻乳汁、乳酪、乳清、沉淀作為檢測對象時，HBV-DNA檢測的陽性率間差異無統計學意義(χ2=0.437，P=0.933)，乳汁中不同成分HBV-DNA載量的分布情況間的差異也無統計學意義(χ2=8.499，P=0.204)。陽性乳汁中檢測出的HBV-DNA載量分布在102～106IU/mL；但在乳清與沉淀中HBV-DNA載量的分布差異有統計學意義(χ2=7.234，P=0.007)：乳清中HBV-DNA載量主要分布在102～104IU/mL，沉淀中HBV-DNA載量主要分布在104～106IU/mL。

通過對4種乳汁成分HBV-DNA載量進行方差分析，發現檢測結果間差異有統計學意義(F=2.835，P=0.043)。為確定哪些成分的檢測結果不同，本文繼而進行SNK檢驗，結果顯示：(1)混勻乳汁、乳酪、乳清間的檢測結果差異無統計學意義(P>0.05)；(2)混勻乳汁、乳酪、沉淀間的檢測結果差異無統計學意義(P>0.05)；(3)乳清與沉淀間的檢測結果差異有統計學意義(P<0.05)，沉淀檢測結果高于乳清檢測結果。造成這一現象的原因考慮是因為乳汁中HBV-DNA主要以游離或物理吸附的形式存在于乳汁懸液和脂肪顆粒、沉淀物表面，通過離心病毒顆粒更多地吸附于沉淀或者脂肪顆粒表面，從而使得乳清中病毒顆粒的載量小于等體積沉淀中的載量；而這種物理吸附導致的差異幅度較小，使得乳清與混勻乳汁、沉淀與混勻乳汁中的HBV-DNA載量間差異無統計學意義(P>0.05)。從定量檢測結果和陽性率來看，混勻乳汁與乳清、混勻乳汁與沉淀間的差異均無統計學意義(P>0.05)，而其更能代表乳汁整體的情況，并且以乳汁整體作為檢測對象已被用作布魯菌中HBV-DNA檢測的經典方法，因此考慮是否將混勻乳汁作為乳汁標本HBV-DNA檢測的對象更為合適。

實際上乳汁經離心或靜置后形成乳酪、乳清、沉淀三層，這三層并非由單一的組分組成，本文將上述三層分別轉移至新的離心管后再次離心發現依然會形成乳酪、乳清和沉淀三層，說明簡單的離心并不能將乳汁中的乳酪、乳清、沉淀嚴格地區分出來。以乳清作為檢測對象的優勢在于缺少了大多數脂肪顆粒和沉淀的影響，更接近于血清的物理形態，可能減少脂類、大顆粒物質對HBV-DNA提取和擴增的抑制作用。但在研究中發現，乳清中HBV-DNA的檢測結果、陽性率與混勻乳汁間差異無統計學意義(P>0.05)，說明乳清并不比混勻乳汁作為檢測對象有明顯優勢。以沉淀作為檢測對象主要是參考分枝桿菌中HBV-DNA提取方法，期望通過離心能使得乳汁中HBV-DNA主要富集在沉淀中，從而提高檢測的陽性率。然而本研究發現經過離心后，沉淀中HBV-DNA檢測的陽性率并不高于混勻乳汁，定量檢測結果與混勻乳汁間的差異也無統計學意義(P>0.05)。以乳酪作為檢測對象進行HBV-DNA檢測很少見于報道，絕大多數學者都是采用棄上層脂質，取乳清/沉淀進行HBV-DNA檢測，這是基于大家普遍認為乳酪中的大量的脂類將會對HBV-DNA檢測造成較為明顯的抑制作用。在本研究中卻發現，乳酪中不僅能夠檢測出HBV-DNA，而且與其他乳汁成分相比HBV-DNA檢測陽性率、檢測結果間的差異無統計學意義(P>0.05)。不過，依然不建議將乳酪作為HBV-DNA的檢測對象，因為：(1)乳酪容易吸附在微量吸嘴內壁及外壁，使得其存在加樣不準確的可能，從而影響檢測結果的準確性和重復性；(2)吸取乳酪時難免會混入部分乳清，使得檢測結果并不能完全代表乳酪中HBV-DNA的載量情況。本文建議將混勻乳汁作為乳汁中HBV-DNA檢測對象基于以下考慮：(1)方法簡單，無需離心或者自然沉淀的過程；(2)將乳汁成分可能對HBV-DNA檢測的影響均勻分攤，使其檢測結果與真值間的差異不會過大；(3)盡量使HBV-DNA在乳汁中分布均勻，從而使得檢測結果更能代表乳汁中HBV-DNA載量的真實情況；(4)加樣準確，不易因加樣誤差而影響檢測結果。

乳汁標本中HBV-DNA定量檢測方法的標準化還有許多問題需要解決。本次研究的結果僅能反映出乳汁中不同成分HBV-DNA檢測結果間的差異，由于缺乏專用的乳汁HBV-DNA檢測質控品，使得對于檢測出的不同乳汁部分中HBV-DNA結果的準確性缺乏判斷依據。同時，由于本次研究中HBV-DNA陽性乳汁例數較少，乳汁中不同成分HBV-DNA檢測結果的差異仍需要通過更多標本的檢測、更完善的試驗設計來探討和研究。

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Analysis of hepatitis B virus DNA quantitative detection results in different breast milk compositions*

WANGDongjian,YUWeitaoΔ,LIUDongping,ZHANGXiaoyun,QIUHuaqin,LIUXian

(DepartmentofBloodTransfusion,184HospitalofPLA,Yingtan,Jiangxi335000,China)

Objective To analyze the results of hepatitis B virus(HBV)-DNA quantitative detection in different breast milk components to provide reference and basis for the HBV-DNA quantitative detection of breast milk sample.Methods The HBV-DNA in the blending milk,cheese,whey and precipitation in 152 hepatitis B parturients was quantitatively detected.Results When choosing different detect objects,there was no statistically significant difference in HBV-DNA detection positive rate(χ2=0.437，P=0.933)；the difference in HBV-DNA loads was statistically significant(F=2.835,P=2.835),the HBV-DNA loads in precipitation was higher than that in whey.There was no statistical significant difference in the pairwise comparison of the test results of blending milk,cheese and whey;also the difference of test results among blending milk,cheese and precipitation was not statistically significant(P>0.05).Conclusion In the HBV-DNA quantitative detection of breast milk sample,the blending milk may be more suitable detection object.

breast milk; hepatitis B virus; DNA

南京軍區醫學科技創新課題資助項目(MS078)。

汪東劍，男，副主任技師，主要從事臨床檢驗與輸血研究。△

，E-mail:dearwdj@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.24.007

A

1673-4130(2016)24-3403-03

2016-09-05

2016-10-24)