丹紅注射液對小鼠感染人巨細胞病毒肝炎的干預研究

秦雪琴，陳悅，吳文琴，雷尚芳，陳德森

(1.十堰市太和醫院,湖北醫藥學院附屬醫院,a.感染科,b.急診科,湖北 十堰 442000;2.湖北醫藥學院,湖北 十堰 442000)

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丹紅注射液對小鼠感染人巨細胞病毒肝炎的干預研究

秦雪琴1a，陳悅1a，吳文琴1b，雷尚芳1a，陳德森2

(1.十堰市太和醫院,湖北醫藥學院附屬醫院,a.感染科,b.急診科,湖北 十堰 442000;2.湖北醫藥學院,湖北 十堰 442000)

目的 研究丹紅注射液對小鼠感染人巨細胞病毒(HCMV)病毒性肝炎的干預機制，為臨床治療HCMV提供理論依據。方法 BALB/c 品系小鼠80只，隨機數字表編號法分對照組、模型組、丹紅注射液A、B、C組(腹腔注射丹紅注射液，劑量分別為0.5、1、2 mg·10 g-1·d-1)，對照組、模型組用生理鹽水干預治療，連續28 d。28 d后尾靜脈采血，放免法檢測小鼠血清肝纖維化血清學指標[Ⅳ型膠原(cⅣ)、層黏連蛋白(LN)、轉化生長因子-βl(TGF-βl)、透明質酸(HA)，Ⅲ型前膠原(PC-Ⅲ)]，用小鼠尾靜脈血血清檢測肝功能五項[天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、膽汁酸(TBA)、總膽紅素(TBil)、谷氨酰轉移酶(GGT)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)]；檢測肝臟組織中肝微粒體細胞色素P450亞型酶[CYP2E1、CYPIA2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9]活性。結果 與模型組比較，丹紅注射液B、C組治療28 d后，P450亞型酶CYP2E1、CYPIA2、CYP3A4酶活性、血清肝纖維化血清學指標cIV、TGF-βl、PC-Ⅲ及肝功能AST、ALT均有不同程度降低(P<0.05)，均差異有統計學意義。丹紅注射液A組各指標間比較，差異無統計學意義，B、C組組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。結論 丹紅注射液可抑制小鼠P450亞型酶活性，降低藥物代謝時對肝臟的毒性，并通過降低TGF-βl而促進肝功能恢復，對小鼠感染，HCMV病性肝炎有明確的治療作用。

丹紅注射液；人巨細胞病毒肝炎；細胞色素P450亞型酶酶；轉化生長因子-βl；肝功能

人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是雙鏈線狀DNA病毒，屬皰疹病毒科，其主要生物學特征為同期性潛伏-活動[1]。HCMV病毒普遍存在于自然界，當抵抗力下降時病毒侵入機體感染肝臟、血液及神經系統； 如感染肝臟會造成嚴重的肝功能損傷，如肝脾腫大、高膽紅素血癥、病理性黃疸，隨著病毒大量復制繁殖，肝臟組織嚴重受損，最終將發展為肝纖維化，并因肝衰竭而造成致死性損傷[2]。本實驗研究首先建立小鼠HCMV肝炎動物模型，觀察丹紅注射液對其細胞色素P450亞型酶、轉化生長因子-βl(TGF-βl)及肝功能等的影響，探討丹紅注射液保肝護HCMV肝炎的作用機制，以期其應用于臨床預防和治療HCMV病毒性肝炎提供實驗及理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 BALB/c 品系小鼠80只，雌雄各半，體質量22～25 g，周齡10～11周，由中國醫學科學院實驗動物中心提供實驗動物，合格證編號為SCXK(京)2005-0013。小鼠采用自由配對原則，隨機數字表編號隨機分為對照組，模型組，丹紅注射液按經腹腔注射劑量的不同分A、B、C組，每組16只(雌雄比為1∶1，每組8對16只)。

1.2 儀器及試劑 Waters2010型高效液相色譜儀；HCMV-AD169病毒(6．0 logTCID50/mL病毒株)作為實驗用毒種[3]；丹紅注射液(菏澤步長制藥有限公司提供，批號：Z20026866)。

1.3 造模及干預方法 參照文獻資料[4]，模型組及丹紅注射液A、B、C組分別經腹腔內接種HCMV-AD169病毒株的病毒懸液[1．0 mL/(6．0logTCID50/mL)]，對照組小鼠腹腔注射生理鹽水(每只1.0 mL)。對照組新生小鼠肝組接種后配對分開飼養，記錄受精時間，待所有新生小鼠出生后第10 天開始干預治療，干預前5組動物中隨機挑選每對小鼠生產的新生小鼠1只(每組各8只新生小鼠)。對照組及模型組腹腔注射0.5 mL生理鹽水，丹紅注射液A、B、C組經腹腔注射丹紅注射液(0.5、1、2 mg·10 g-1·d-1)進行干預，全部動物均干預治療28 d。實驗期間動物福利：飼養環境要求動物房恒溫(22 ℃，濕度50%～75%)，配對分開飼養單籠飼養，12 h交替光照；飼養要求滿足實驗動物倫理[5]，小鼠自由飲水，普通飼料喂養，觀察動物飲水進食情況，小鼠生產新生小鼠后及時清理糞便。本模型建立選用目前成熟可靠的技術，利用HCMV可經胎盤垂直傳播至子代新生小鼠的生物學特性，且經聚合酶鏈反應(PCR)法對子代小鼠尾靜脈血分離培養均得出HCMV-DNA的陽性結果，造模成功率為100%。

1.4 檢測指標及方法 參照文獻[6]，小鼠斷尾后用取樣器吸取靜脈血0.1 mL，置于已編號的肝素管中，放免法檢測小鼠血清肝纖維化血清學指標[Ⅳ型膠原(cⅣ)、層黏連蛋白(LN)、TGF-βl、透明質酸(HA)，Ⅲ型前膠原(PC-Ⅲ)]，常規檢測小鼠肝功能五項[天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、膽汁酸(TBA)、總膽紅素(TBil)、谷氨酰轉移酶(GGT)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)] 。小鼠取血后，斷頭處死，取肝組織置于已編號的容器內放入-4 ℃冰箱暫存，采用高效液相色譜法(HPLC)檢測P450亞型酶。檢測前先將肝組織搗碎研磨，4 ℃下按1∶4比例加入勻漿緩沖液(11．5 g·L-1氯化鉀，50 mmol·L-1Tris，pH 7.4)勻漿，用GR22GⅡ型高速冷凍離心機差速離心法勻漿，5 000 r·min-1離心30 min后離心管中沉淀的組織重懸于0.25 mol·L-1蔗糖溶液中即為小鼠肝微粒體提取液標本，分別編號置于-80 ℃冰箱暫存備用。檢測時取出標本置于SHA-C水浴恒溫振蕩器解凍并振蕩30 min，37 ℃先孵育30 min，再5 000 r·min-1離心20 min 后用取樣器取上清液 250 μL備用，采用Waters 2010型高效液相色譜儀進樣檢測。P450酶含量測定： 用 pH 7.4 的磷酸緩沖液將提取的小鼠肝微粒體提取液(250 μL上清液)加入 4 mg 連二亞硫酸鈉，反應 4 min，將其平分到比色皿中，在紫外分光光度計上掃描基線， 然后向樣品杯中通入 CO 30 s，穩定 5 min，在波長 400～500 nm 范圍內掃描得到P450-CO 復合物吸收光譜。 計算公式：P450含量(μmol·L-1)=[△OD(450～490 nm)×1 000]/[91×微粒體蛋白濃度(g·L-1)]。

2 結果

2.1 丹紅注射液對小鼠P450亞型酶的影響 如表1。對照組P450亞型酶酶中CYP2E1、CYPIA2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9活性均保持正常水平。模型組P450亞型酶表達均明顯增強，與對照組比較,P<0.05，差異有統計學意義。丹紅注射液B、C組經28 d治療，CYP2E1、 CYPIA2、CYP3A4明顯降低，與模型組比較,差異有統計學意義(P<0.05)。B、C組組間比較,差異無統計學意義(P>0.05)，丹紅注射液A組有下降趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 丹紅注射液對小鼠血清肝纖維化血清學指標的影響 見表2。模型組小鼠血清肝纖維化血清學指標(cⅣ、LN、TGF-βl、HA、PC-Ⅲ)顯著升高，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，說明母代小鼠均感染HCMV病毒， HCMV已垂直傳播給子代小鼠，HCMV病毒增殖造成肝纖維化病理改變。丹紅注射液B、C組經28 d治療，cIV、TGF-βl及PC-Ⅲ明顯降低，與模型組比較,差異有統計學意義(P<0.05)。B、C組組間比較,差異無統計學意義(P>0.05)，但丹紅注射液A組降低不明顯(P>0.05)。2.3 丹紅注射液對小鼠肝功能的影響 模型組小鼠肝功能五項(AST、TBA、TBiL、GGT、ALT)均顯著升高，與對照組比較,差異有統計學意義(P<0.05)，說明子代小鼠均感染HCMV病毒后造成嚴重的肝功能損害。丹紅注射液B、C組經28 d治療，AST及ALT明顯降低，與模型組比較,P<0.05，B、C組組間比較(P>0.05)。TBA、GGT 、TBil有下降趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)，丹紅注射液A組僅AST差異有統計學意義。如表3。

3 討論

機體感染HCMV后在肝臟組織復制繁殖，破壞肝細胞，造成大量肝細胞變性、壞死，肝星狀細胞被激活、增殖和轉化等病理改變并最終導致肝臟組織纖維化而喪失解毒功能，肝功能及血清肝纖維化血清學等指標異常升高。P450同工酶是主要存在于肝細胞內質網，是機體混合功能氧化酶系的主要成分，有數十種亞型，目前證實與藥物代謝關系密切的有CYP2E1、CYPIA2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9等[7]。藥物90%均經P450亞型酶代謝，故影響P450亞型酶活性的藥物均會影響藥物的療效， P450亞型酶活性增強常會導致過敏等不良反應，并造成藥物的治療作用降低，而P450亞型酶活性降低會使經此酶代謝藥物代謝減慢，血藥濃度升高而增強療效[8]。近年來大量中草藥提取液如丹紅注射液等被嘗試應用到臨床治療HCMV并取得一定療效，丹紅注射液是將中藥丹參、紅花按科學配方提取的復方注射液。《藥品化義》記載紅花味辛性溫、善通利經脈，《吳普本草》記載丹參味辛性涼、可治心肌腹痛[9]。丹參主要有效成分包括丹參酚酸、丹參酮、紅花黃色素等，其性苦，微寒，歸心、心包、肝經，既能活血又可清熱；紅花主要成分有紅花素、紅花醌及紅花苷等，辛溫，歸心、肝經，具活血化瘀之效，同時辛溫之性有助于化痰濕，兩藥合用共奏活血清熱化痰之功[10]，兩藥一溫一涼，具有調經鎮痛、涼血消癰、活血通經、散癖鎮痛之功效，能有效降低血液黏稠度、改善微循環，正合中醫治療肝病的原則[11]。

觀察發現，小鼠感染HCMV后出生的新生代小鼠均垂直傳染HCMV病毒，因為除對照外，其它4組小鼠cIV、LN、TGF-βl、HA、PC-Ⅲ及肝功能五項(AST、TBA、TBil、GGT、ALT)均異常增高。在用丹紅注射液干預治療28 d后，模型組P450亞型酶活性、cIV、LN、TGF-βl、HA、PC-Ⅲ及肝功能五項(AST、TBA、TBil、GGT、ALT)均無明顯改善，而丹紅注射液B、C組P450亞型酶CYP2E1、CYPIA2、CYP3A4酶活性、血清肝纖維化血清學指標中cIV、TGF-βl、PC-Ⅲ及肝功能AST、ALT均明顯降。多項研究表明，P450亞型酶CYP2E1、CYPIA2、CYP3A4與藥物代謝及相互作用密切相關，其降低有利于藥物的代謝并減少不良反應、增加療效[12]。丹紅注射液B、C組P450亞型酶CYP2E1、CYPIA2、CYP3A4酶活性降低的機制因缺乏相關的實驗報告，但在本臨床觀察印證丹紅注射液確具有降低CYP2E1、CYPIA2、CYP3A4酶活性的作用。丹紅注射液B、C組的cIV、TGF-βl、PC-Ⅲ等指標的下降應與丹紅注射液具有活血化瘀，增加肝血流量進而改善肝臟組織微循環有關。HCMV病毒在肝臟增殖時會對正常肝細胞造成嚴重破壞，肝細胞壞死時Na+，K+-ATP酶活性會降低，肝細胞能量的代謝障礙，并導致肝細胞修復能力下降。結合機體電生理特點來看，丹紅注射液可能具有增強了Na+，K+-ATP酶活性,促使cIV、TGF-βl、PC-Ⅲ降低，抑制HCMV病毒對肝細胞的破壞，改善肝細胞內有毒物質代謝而起到細胞保護作用[13]。另外，HCMV會造成小鼠肝臟蛋氨酸腺苷蛋氨酸環化酶和Na+，K+-ATP酶活性降低，模型組及丹紅注射液A、B、C組小鼠肝細胞大量破壞、腫脹、變性壞死，造成小鼠肝功能異常升高。在使用丹紅注射液干預治療28 d后，丹紅注射液B、C組肝功能中AST、ALT明顯降低，說明其對已感染HCMV的肝臟具有保護作用。大量實驗及臨床研究證實丹紅注射液具有活血化瘀，涼血消癰的藥理特性[14]。在本實驗中，我們觀察到丹紅注射液可抑制小鼠P450亞型酶活性，這對降低藥物代謝時對肝臟的毒性，增強藥物療效，促進肝功能恢復起到了至關重要的作用。丹紅注射液還通過降低TGF-βl而促進肝功能恢復，并有可能具有增強Na+，K+-ATP酶泵功能，促進質膜磷脂甲基化，改善肝臟組織微循環，增加肝臟組織供氧，抑制HCMV增殖引起的炎性反應造成的肝損傷而達到保護肝臟的目的，對小鼠感染HCMV病毒病性肝炎有明確的干預治療作用。

表1 小鼠P450 亞型酶活性比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

表2 小鼠肝纖維化血清學指標比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

表3 小鼠肝功能五項比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型比較，bP<0.05。

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Intervention of danhong injection on mice infected with hepatitis HCMV

QIN Xueqina,CHEN Yuea,WU Wenqinb,et al

(a.DepartmentofInfectiousDiseases，b.EmergencyDepartment,TaiheAffiliatedHospitalofHubeiMedicalCollege,Shiyan,Hubei442000,China)

Objective To explore the intervention mechanism of Danhong Injection on mice infected with human cytomegalovirus(human cytomegalovirus，HCMV)viral hepatitis,to provide theoretical basis for clinical treatment of HCMV.Methods Eighty BALB/c strain mice were randomized into control group,model group,Danhong Injection A,B,C group,by intraperitoneal injection of Danhong Injection(0.5,1,2 mg·10 g-1·d-1).The control group and model group received normal saline intervention therapy for 28 days.28 days later,blood samples were collected from tail vein for immunoassay detection of serum markers of liver fibrosis in mice [Ⅳ collagen(cⅣ),laminin(LN),transforming growth factor beta 1(TGF-β1),hyaluronic acid(HA),type Ⅲ procollagen(PC-Ⅲ)],detection of liver functions in mice [aspartate aminotransferase(AST),bile acid(TBA),total bilirubin(TBil),gamma glutamyl transferase(GGT)alanine aminotransferase(ALT)],and the activities of liver microsomal cytochrome P450isoforms [CYP2E1,CYPIA2,CYP3A4,CYP2D6 AND CYP2C9].Results Compared with the model group,28 days after the treatment,activities of CYP2E1,CYPIA2 and CYP3A4,cIV,TGF-βl,PC-III,AST and ALT were all decreased in Danhong Injection B and C group with significant differences(P<0.05).There was no statistically significant difference among Danhong Injection A,B and C group(P>0.05).Conclusions Danhong Injection can inhibit the activity of P450isoforms in mice,decrease toxicity to liver during drug metabolism and promote the recovery of liver function by reducing TGF-βl,which achieves obvious efficacy on mice-infected human cytomegalovirus hepatitis.

Danhong injection;Human cytomegalovirus hepatitis;Cytochrome P450enzyme;Transforming growth factor beta 1;Liver function

湖北省衛生與計劃生育委員會重點項目(WJ2015MB224)

陳德森，男，副教授，研究方向：HCMV肝炎治療與肝移植，E-mail：fenyanqin163163@126.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.11.008

2016-05-11，

2016-08-07)