葛根素對腎缺血再灌注大鼠腎臟組織的保護作用及其機制研究

朱敏杰，郝海英，陳潔，趙京梅，郝曉娟

(邯鄲市中心醫院,a.腎內二科，b.腎呼吸內科，河北 邯鄲 056001)

?

◇藥學研究◇

葛根素對腎缺血再灌注大鼠腎臟組織的保護作用及其機制研究

朱敏杰a，郝海英a，陳潔a，趙京梅b，郝曉娟a

(邯鄲市中心醫院,a.腎內二科，b.腎呼吸內科，河北 邯鄲 056001)

目的 研究葛根素對腎缺血再灌注大鼠腎臟組織的保護作用及其機制。方法 將120只實驗用大鼠隨機數字表法分為6組：假手術組，模型組，葛根素高劑量(100 mg·kg-1)、中劑量(50 mg·kg-1)、低劑量(25 mg·kg-1)治療組，銀杏葉提取物(100 mg·kg-1)治療組；采用夾閉雙側腎蒂血管45 min后松夾恢復血流灌注的方法建立腎缺血再灌注大鼠模型；再灌注后立即腹腔注射給藥，每天1次，療程2周。稱量各組大鼠體質量、腎臟重量并計算腎臟指數，測定24 h尿量和24 h尿蛋白量(UPro)，測定血清中血尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、尿酸(UA)含量，通過蘇木精-尹紅(HE)染色觀察腎臟組織形態結構改變；末端標記法(TUNEL)觀察腎小球細胞凋亡狀況，并計算凋亡指數(AI)；測定腎臟組織中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量，通過ELISA法測定血清中白介素-1(IL-1)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量水平。結果 較模型組，葛根素高、中劑量組大鼠腎臟重量減輕且腎臟指數降低，24 h尿量和UPro均減少，血清中BUN、SCr、UA含量降低，上述均差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)；葛根素治療組大鼠腎臟組織病變和腎小球細胞凋亡狀況呈不同程度改善，以葛根素高劑量組效果最為顯著，并且葛根素高、中劑量組大鼠腎小球細胞凋亡指數較模型組降低(P<0.05，P<0.01)；葛根素高、中劑量組腎臟組織中SOD、CAT活性升高且MDA含量降低，血清中IL-1和TNF-α含量降低，且高劑量組GSH-Px活性升高，上述均差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。結論 葛根素對腎缺血再灌注大鼠腎臟組織具有保護作用；其機制可能與葛根素能夠有效改善抗氧化酶活性、降低氧化應激損傷、抑制炎性反應有關。

葛根素；腎臟；缺血再灌注；保護；機制

腎缺血再灌注損傷(renal ischemia-reperfusion injury,RIRI)是臨床上開展腎臟手術以及失血、休克時常發生的腎組織損傷現象，其發病機制尚未完全明確。近年來病理生理學研究發現隨著腎臟血流恢復供應，氧大量涌入而導致氧自由基的大量生成與過剩，誘發腎臟組織氧化應激損傷以及繼發的細胞凋亡是造成RIRI的重要因素[1-2]。黃仁發等[3]研究均發現，炎性反應在RIRI的發生發展進程中也發揮著重要作用。葛根素(puerarin)是我國傳統中藥葛根的主要有效成分，現代藥學研究發現，葛根素屬于異黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、調脂、抗凋亡等多種生物學活性[4-7]。銀杏葉提取物具有活血、化淤、通絡的功效，廣泛應用于腦部及周圍血流循環障礙[8]，并且銀杏葉提取物能夠改善抗氧化酶活性、降低氧化應激損傷、抑制腎小球細胞凋亡而對RIRI起到確切的保護作用[9]。本研究采用夾閉雙側腎蒂血管45 min后松夾恢復血流再灌注的方法建立的腎缺血再灌注大鼠模型，并以銀杏葉提取物為陽性對照，研究葛根素對腎缺血再灌注大鼠腎臟組織的保護作用并探討其作用機制。

1 材料

1.1 藥物與試劑 葛根素注射液(江西銀濤藥業有限公司，規格：2 mL:100 mg，批號 20140518)；金納多注射液(德國威瑪舒培大藥廠，每支5 mL，含有銀杏提取物17.5 mg，批號1514904)；血尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、尿酸(UA)、24 h尿蛋白量(UPro)試劑盒購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)活性、丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；白介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯免疫(ELISA)試劑盒，TUNEL染色試劑盒購自北京博奧森公司；烏拉坦購自北京化學試劑公司。

1.2 實驗動物 實驗用SD大鼠(清潔級，雄性，7周齡，體質量180～220 g)，購自河北省實驗動物中心，許可證號：SCXK(冀)2013-1-003，動物批號：20140912。

1.3 主要儀器 UV759紫外-可見分光光度計(上海圣科儀器設備有限公司)；BS-200型生化分析儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)；iMark型酶標儀(美國 Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 動物分組與模型的制備 將120只實驗用SD大鼠采用隨機數字表法隨機分為6組：假手術組，模型組，葛根素高劑量(100 mg·kg-1)、中劑量(50 mg·kg-1)、低劑量(25 mg·kg-1)治療組，銀杏葉提取物(100 mg·kg-1)治療組，各20只；除假手術組外，其余各組大鼠均參照Chatterjee等[10]報道的方法制備腎缺血再灌注大鼠模型：實施麻醉后于脊柱雙側行腎區切口、暴露雙側腎臟，剝離雙側腎蒂血管并用無創動脈夾夾閉45 min后松夾恢復血流灌注，逐層縫合；假手術組大鼠行手術通路但不夾閉腎蒂血管。通過HE染色觀察組織病理切片發現，假手術組大鼠腎臟組織結構完整、腎小管結構完整；而模型組大鼠腎臟組織呈現腎小管結構破壞、腎小管上皮細胞變性壞死、管腔內可見脫落的細胞和管型尿，間質區可見淋巴細胞浸潤等明顯的病理性形態學變化，結果見圖1，說明造模成功。各治療組分別于再灌注后立即通過腹腔注射給藥，假手術組和模型組均同步給予等體積生理鹽水，每天1次，療程2周。

圖1 大鼠腎臟組織形態學變化(HE×400)

2.2 體質量、腎臟質量的稱量及腎臟指數的計算 治療完成后稱量各組大鼠體質量；麻醉后取腎臟組織并稱量左側腎質量，然后計算腎臟指數：

腎臟指數(mg·g-1)=左側腎臟質量(mg)/體質量(g)

2.3 24 h尿量及UPro的測定 治療完成后，插導尿管并測量各組大鼠24 h尿量，并按照試劑盒操作方法步驟分析測定各組大鼠UPro水平。

2.4 血清中BUN、SCr、UA含量的測定 治療完成后經腹主動脈取血，離心(2 000 r·min-1，5 min)后取血清，按照各測定試劑盒操作方法進行處理后，通過全自動生化分析儀測定各組大鼠血清中BUN、SCr、UA含量。

2.5 腎臟組織形態結果改變的觀察 取“2.2”步驟稱量后的左側腎臟組織，置于4%的多聚甲醛溶液中進行固定，經石蠟包埋、切片(厚度為5 μm)和展片處理后，行常規HE染色和復染，通過光學顯微鏡觀察腎臟組織形態結構變化。

2.6 腎小球細胞凋亡狀況的觀察及凋亡指數(Apoptosis Index，AI)的計算 取“2.5”所制備的石蠟組織切片經脫蠟水化處理后，按照TUNEL染色試劑盒操作方法步驟依次進行處理，然后通過光學顯微鏡觀察各組大鼠腎小球細胞凋亡狀況。AI的計算：每只大鼠取5張切片，每張切片隨機選取6個視野，計數每個視野中細胞總數以及陽性細胞數(細胞核黃染)，取平均值，然后計算AI：

AI(%)=(凋亡細胞數/總細胞數)×100%

2.7 腎臟組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量的測定 取右側腎臟組織，剪碎、加入適量冷裂解液后研磨勻漿，離心(3 000 r·min-1，10 min)后取上清液，然后按照試劑盒操作方法步驟，采用比色法、通過紫外-可見分光度計測定各組大鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量。

2.8 血清中IL-1和TNF-α含量的測定 取“2.4”所制備的血清，按照ELISA試劑盒操作方法步驟進行處理，最后通過酶標儀測定各組大鼠血清中IL-1和TNF-α含量。

3 結果

3.1 葛根素對腎缺血再灌注大鼠腎臟質量及腎臟指數的影響 結果如表1所示，與假手術組比較，模型組大鼠腎臟質量和腎臟指數均升高(P<0.01)；經葛根素高、中劑量治療2周后，腎缺血再灌注損傷大鼠腎臟質量減輕且腎臟指數降低(P<0.05，P<0.01)。

3.2 葛根素對腎缺血再灌注大鼠24 h尿量和UPro的影響 結果如表2所示，與假手術組比較，模型組大鼠24 h尿量和UPro均升高(P<0.01)；經葛根素高、中劑量治療2周后，腎缺血再灌注損傷大鼠24 h尿量和UPro均降低(P<0.05，P<0.01)。

表1 葛根素對腎缺血再灌注大鼠腎臟質量及腎臟指數的影響

注：與假手術組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05,cP<0.01。

表2 葛根素對腎缺血再灌注大鼠24 h尿量和UPro的影響

注：與假手術組比較，aP<0.01；與模型組比較：bP<0.05,cP<0.01。

3.3 葛根素對腎缺血再灌注大鼠血清中BUN、SCr、UA含量的影響 結果如表3所示，與假手術組比較，模型組大鼠血清中BUN、SCr、UA含量升高(P<0.01)；經葛根素高、中劑量治療2周后，腎缺血再灌注損傷大鼠血清中BUN、SCr、UA含量降低(P<0.05，P<0.01)。

表3 葛根素對腎缺血再灌注大鼠血清中BUN、SCr、UA含量的影響

注：與假手術組比較，aP<0.01；與模型組比較：bP<0.05,cP<0.01。

3.4 葛根素對腎缺血再灌注大鼠腎小球細胞凋亡的影響 結果如圖2所示，假手術組大鼠腎臟組織僅存在極少量的凋亡細胞；而模型組大鼠腎小球細胞凋亡數量增多，經葛根素治療2周后，腎缺血再灌注損傷大鼠腎小球細胞凋亡數量減少，以葛根素高劑量組效果最為顯著；計算AI結果如表4所示：與假手術組比較，模型組大鼠細胞AI升高(P<0.01)，經葛根素高、中劑量治療2周后，腎缺血再灌注損傷大鼠細胞AI降低(P<0.05，P<0.01)。

圖2 葛根素對腎缺血再灌注大鼠腎小球細胞凋亡的影響(HE×400)

表4 葛根素對腎缺血再灌注大鼠腎小球細胞AI的影響

注：與假手術組比較：aP<0.01；與模型組比較：bP<0.05,cP<0.01。

3.5 葛根素對腎缺血再灌注大鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量的影響 結果如表5所示，與假手術組比較，模型組大鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px、CAT活性低且MDA含量升高(P<0.01)；經葛根素高、中劑量治療2周后，腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎臟組織中SOD、CAT活性升高且MDA含量降低(P<0.05，P<0.01)，高劑量治療組GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)。

3.6 葛根素對腎缺血再灌注大鼠血清中IL-1和TNF-α含量的影響 結果如表6所示，與假手術組比較，模型組大鼠血清中IL-1和TNF-α含量均升高(P<0.01)；經葛根素高、中劑量治療2周后，腎臟缺血再灌注大鼠血清中IL-1和TNF-α含量降低(P<0.05，P<0.01)。

表5 葛根素對腎缺血再灌注大鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量的影響

注：與假手術組比較：aP<0.01；與模型組比較：bP<0.05,cP<0.01。

表6 葛根素對腎缺血再灌注大鼠血清中IL-1和TNF-α含量的影響

注：與假手術組比較，aP<0.01；與模型組比較：bP<0.05,cP<0.01。

4 討論

腎臟組織血流量非常豐富，對缺血再灌注損傷非常敏感，常見于腎臟手術、嚴重出血、休克等之后。RIRI是導致腎功能衰竭的危險因素之一，其死亡率高達50%以上[11]。目前對RIRI的發病機制尚未明確，有研究發現氧化應激、炎性反應以及繼發的細胞凋亡在其發生發展過程中發揮著非常重要的作用。游離并夾閉雙側腎蒂血管45 min后松夾恢復血流灌注是制備RIRI大鼠模型的常用方法[10]，該方法制備的模型大鼠呈現腎臟組織氧化應激損傷、炎性反應、細胞凋亡以及腎小管率過濾升高且重吸收率降低所致尿量、24 h UPro、BUN、SCr、UA增多等病理性改變。

體內活性氧自由基(ROS)過剩是導致機體氧化應激損傷的病理基礎，正常生理狀態下，ROS的生成與清除處于動態平衡，其中抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)對ROS的清除發揮著重要的催化作用[12-14]；當ROS生成增多或抗氧化酶活性降低時，將導致體內ROS的過剩而攻擊細胞膜而造成臟器的脂質過氧化損傷，因此脂質過氧化終產物MDA的含量也能夠間接反映氧化應激損傷程度。炎癥因子IL-1和TNF-α在RIRI的發生和發展過程發揮重要的介導作用[15]，IL-1能夠引發中性粒細胞向腎組織浸潤，從而加劇腎組織損傷；TNF-α不但具有直接細胞毒作用，而且還能夠促進IL-1等細胞因子的產生，從而加劇炎性細胞的浸潤和聚集。

細胞凋亡是一種程序性死亡，該過程中存在著非常復雜的調控機制，其中Bcl-2基因家族和Caspase蛋白家族在細胞凋亡過程中起著非常重要的調控作用[16]。細胞凋亡具有多種誘發因素，包括氧化應激損傷，而NF-κB蛋白則被稱為連接氧化應激和細胞凋亡的“橋梁”；常態下，NF-κB以無活性形式存在于胞質中，而當受到外界因素刺激時NF-κB將進入胞核并調控靶基因的轉錄與表達。

本研究通過夾閉雙側腎蒂血管45 min后松夾恢復血流灌注的方法建立腎缺血再灌注大鼠模型，通過HE染色觀察病理切片、TUNEL染色觀察細胞凋亡、檢測炎癥細胞因子以及尿量、UPro、BUN、SCr、UA指標發現其病理性改變與Chatterjee等[10]的研究結果基本一致。本實驗研究發現，經過葛根素治療能夠有效降低RIRI大鼠腎臟指數，減少尿量和尿蛋白量，降低BUN、SCr、UA含量，改善腎功能、降低腎小管率過濾、提高腎小管重吸收率，改善腎臟組織病變、抑制腎小球細胞凋亡；進一步研究發現，葛根素治療能夠有效改善RIRI大鼠腎臟組織抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性、降低MDA含量、降低炎癥細胞因子(IL-1、TNF-α)水平；提示葛根素對腎缺血再灌注大鼠腎臟組織具有保護作用，其機制可能與葛根素能夠改善腎小球濾過率和腎小管重吸收率、降低尿量，抑制氧化應激損傷、抑制細胞凋亡和炎性反應有關。

[1] 劉小勇,陳勝龍.丹參酮ⅡA 聯合參麥注射液對腎缺血-再灌注大鼠氧化應激及腎功能的影響[J].實用醫院臨床雜志，2014,11(4):62-64.

[2] 許瑞瑞,宋年華,徐巖,等.腎缺血再灌注損傷對細胞凋亡的影響[J].青島大學醫學院學報,2015,51(1):29-34.

[3] 黃仁發,賴虹伊,梁群卿,等.Notch2/Hes-1信號通路活化參與調控腎缺血-再灌注誘導炎癥因子的表達研究[J].中國現代醫學雜志,2015,25(17):5-11.

[4] 劉嬌梅.葛根素對妊娠期糖尿病大鼠氧化應激損傷保護作用的研究[J].中藥藥理與臨床,2015,31(5):54-57.

[5] 王會敏,田煒,喇孝瑾,等.葛根素、齊墩果酸及其配伍對T2DM大鼠氧化應激和炎性反應的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(15):174-177.

[6] 程遠渡,易有金,易傳祝,等.植物甾醇酯和葛根素聯合使用對高脂血癥小鼠降血脂作用研究[J].中國油脂,2015,40(4):64-68.

[7] 張玲,龐莉,高俊虹,等.葛根素對糖尿病大鼠心肌細胞凋亡及相關蛋白表達的影響[J].中國中醫基礎醫學雜志,2011,17(3):323-325.

[8] 沈秀珍,王凌,方毅華.銀杏總黃酮通過調節自噬減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷的研究[J].安徽醫藥,2016,20(6):1065-1067.

[9] 姚丹丹,唐高興.銀杏葉提取物對腎缺血再灌注損傷的保護作用[J].實用醫學雜志,2008,24(9):1495-1496.

[10] Chatterjee PK,Brown PJ,Cuzzocrea S,et al.Calpain inhibitor1 reduces renal ischemia/ reperfusion injury in the rat[J].Kidney International,2001,59(6):2073-2083.

[11] 于金寶,王兵,崔堯麗,等.z-VAD-FMK對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用[J].天津醫科大學學報,2014,20(2):89-92.

[12] Wided K,Hassiba R,Mesbah L.Polyphenolic fraction of Algerian propolis reverses doxorubicin induced oxidative stress in liver cells and mitochondria[J].Pak J Pharm Sci,2014,27(6):1891-1897.

[13] Syed SN,Rizvi W,Kumar AA,et al.In vitro antioxidant and in vivo hepatoprotective activity of leave extract of Raphanus sativus in rats using CCL4 model[J].Afr J Tradit Complement Altern Med,2014,11(3):102-106.

[14] Cheng L,Jin Z,Zhao R,et al.Resveratrol attenuates inflammation and oxidative stress induced by myocardial ischemia-reperfusion injury:role of Nrf2/ARE pathway[J].Int J Clin Exp Med,2015,8(7):10420-10428.

[15] 郭愛民,曹建民,周海濤.紅景天對大鼠運動性腎缺血再灌注血清和腎組織中 IL-1β、TNF-α、IL-6 和 IL-18 水平的影響[J].沈陽體育學院學報,2013,32(5):74-78.

[16] 袁芳.山楂葉總黃酮對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞凋亡及bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達的影響[J].遼寧中醫藥大學學報,2016,18(7):57-60.

Protection and mechanism of puerarin on the kidneys in ischemic-reperfusion rats

ZHU Minjie,HAO Haiying,CHEN Jie,et al

(SecondDepartmentofNephrology,HandanCentralHospital,Handan,Hebei056001,China)

Objective To investigate the protection and mechanism of puerarin on the kidneys in ischemic-reperfusion rats.Methods One hundred and twenty experimental rats were randomized into six groups:sham operation group,renal ischemic-reperfusion model control group,puerarin 25,50,100 mg·kg-1treatment groups and ginkgo biloba extract(EGb)100 mg·kg-1treatment group.The model rats were made by gripping bilateral renal pedicle vascular for 45min,then the drugs were given immediately after reperfusion,once a day for 2 weeks.Two weeks later,the body mass and renal weight were determined and the renal index(RI)was calculated;the urine volume and the UPro were determined;the content of BUN,SCr,UA in serum were determined;the histopathological changes of renal tissue were observed by HE staining;the apoptosis of renal cells was observed by TUNEL staining,and the apoptosis index(AI)was calculated;the activities of SOD,GSH-Px and CAT and the content of MDA in renal tissue were determined;the contents of IL-1 and TNF-α in serum were determined by ELISA.Results Compared with renal ischemic-reperfusion model control group,the renal weight and RI in puerarin(50,100 mg·kg-1)treatment groups were significantly decreased(P<0.05,P<0.01);the urine volume and the UPro in puerarin(50,100 mg·kg-1)treatment groups were significantly decreased(P<0.05,P<0.01),and the content of BUN,SCr,UA in serum were significantly decreased(P<0.05,P<0.01).The histopathological changes and the apoptosis of the renal tissue in puerarin treatment groups were significantly improved,especially in the puerarin 100 mg·kg-1treatment group,and theAIof puerarin(50,100 mg·kg-1)treatment groups were significantly decreased(P<0.05,P<0.01).The activities of SOD,CAT in renal tissue of puerarin(50,100 mg·kg-1)treatment groups were significantly increased and the contents of MDA were significantly decreased(P<0.05,P<0.01),the contents of IL-1 and TNF-α in serum were significantly decreased(P<0.05,P<0.01),and the activity of GSH-Px of puerarin 100 mg·kg-1treatment group was significantly increased(P<0.05,P<0.01).Conclusions Puerarin had protective effects on kidneys in ischemic-reperfusion rats,which was perhaps related to its effects on improving the activity of antioxidant enzymes,reducing oxidative stress injury and inhibiting inflammatory response.

Puerarin;Kidneys;Ischemic-reperfusion;Protection;Mechanism

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.11.006

2016-04-23，

2016-08-07)