豬卵巢顆粒細胞分離培養及細胞生物學特性研究

閆益波，李文剛，焦福林，吳志娟，胡廣英，周勝花，隋 朝，岳 磊，任毅菲

（山西省農業科學院畜牧獸醫研究所，山西太原030032）

豬卵巢顆粒細胞分離培養及細胞生物學特性研究

閆益波，李文剛，焦福林，吳志娟，胡廣英，周勝花，隋 朝，岳 磊，任毅菲

（山西省農業科學院畜牧獸醫研究所，山西太原030032）

顆粒細胞是研究雌性動物生殖生理、病理、藥理和毒理機制的重要細胞模型。采用常規細胞培養的方法，建立豬卵巢顆粒細胞培養系統并研究其生物學特性。結果顯示，抽吸法和剖切法分離豬卵巢顆粒細胞各有利弊，但都對細胞的活率影響不顯著；有血清的培養效果好于無血清，而且以胎牛血清的效果較好，基礎培養基DMEM和TCM199的培養效果相似，以DMEM＋10%FBS培養效果最好；形態學觀察發現了顆粒細胞貼壁生長和缺乏接觸抑制的現象，體外生長曲線符合貼壁細胞的生長特征，DAPI熒光染色法沒有檢測到支原體污染，細胞生長狀態良好。

豬；顆粒細胞；分離；細胞培養

顆粒細胞是卵泡發育和閉鎖過程中最重要的體細胞，在卵泡局部微環境調節系統中發揮著重要的作用。早期研究表明，卵泡閉鎖的實質是顆粒細胞的凋亡[1-3]，只有充分認識了顆粒細胞的生物學特性，才可以進一步認識卵泡和卵子的發育規律。豬作為多胎哺乳動物，每個生殖周期有多個卵泡發育成熟并排卵，是研究雌性哺乳動物卵泡發育的良好動物模型，建立適宜的豬卵巢顆粒細胞分離培養體系不僅為豬卵巢生物學研究建立了體外技術平臺，同時為豬卵巢生殖毒理學研究提供細胞試驗模型[4-5]。

本研究通過建立適宜的豬卵巢顆粒細胞分離培養系統，為體外研究豬卵巢生理、病理、藥理和毒理機制提供研究平臺。

1 材料和方法

1.1 試劑與設備

TCM199培養液（T），DMEM培養液（D），胎牛血清（FBS），新生牛血清（NCS），超凈工作臺，胰蛋白酶，PBS，DAPI，青霉素，鏈霉素，谷氨酰胺，倒置顯微鏡，二氧化碳培養箱，離心機等。

1.2 顆粒細胞的分離

采集母豬卵巢，用含雙抗的滅菌生理鹽水沖洗5次，洗凈卵巢上的血污，裝入大燒杯并用37℃左右的滅菌生理鹽水淹沒后帶入無菌室。在無菌操作室，放在37℃的水浴鍋里保溫采集卵巢顆粒細胞。分別使用抽吸法和剖切法分離豬卵巢顆粒細胞。

抽吸法：將清理后的卵巢置于滅菌培養皿中，用帶18號針頭的一次性注射器抽吸卵巢表面直徑2～6 mm和大于6 mm的卵泡中的卵泡液，抽取的卵泡液用洗卵液稀釋后，靜置5～10 min，在光鏡下使用拉制好的玻璃吸管除去卵丘-卵母細胞復合體，剩余脫落顆粒細胞反復吹打后，吸取全部卵泡液和顆粒細胞，置于離心管內以2 000 r/min離心5 min，細胞培養液重懸計數后體外培養。

剖切法：將卵巢置于培養皿中，然后用手術刀片對卵巢皮質進行縱橫方向1～2 mm間距的切割，然后用PBS反復沖洗，將沖洗液靜置5～10 min，倒出上層清液，然后在光鏡下使用拉制好的玻璃吸管除去卵丘-卵母細胞復合體，剩余脫落顆粒細胞反復吹打后，吸取全部卵泡液和顆粒細胞，置于離心管內以2 000 r/min離心5 min，細胞培養液重懸計數后體外培養。

1.3 臺盼蘭排斥實驗檢測細胞活率

用離心管收集顆粒細胞，加入胰蛋白酶并輔助機械吹打的方式使分散，PBS洗2遍后，調節細胞為適當密度（1×105個/mL）左右，與0.04%的臺盼蘭以1∶2的比例混勻，染色1 min后用細胞計數板計數，其中，細胞全部呈藍色的為死亡細胞，細胞中間透明不著色的為活細胞，細胞的存活率＝活細胞數/（活細胞數＋死亡細胞數）×100%。

1.4 基礎培養基與血清對顆粒細胞培養的效果

設計6種組成培養基，接種后24，48 h在光學顯微鏡下觀察培養顆粒細胞的生長狀態。

6組培養基分別為：T.TCM199＋100 mmol/L谷氨酰胺＋100 IU/mL青鏈霉素；T＋10%FBS. TCM199＋100 mmol/L谷氨酰胺＋100 IU/mL青鏈霉素＋10%FBS；T＋10%NCS.TCM199＋100 mmol/L谷氨酰胺＋100IU/mL青鏈霉素＋10%NCS；D.DMEM（高糖）＋100 mmol/L谷氨酰胺＋100 IU/mL青鏈霉素；D＋10%FBS.DMEM（高糖）＋100 mmol/L谷氨酰胺＋100 IU/mL青鏈霉素＋10%FBS；D＋10% NCS.DMEM（高糖）＋100 mmol/L谷氨酰胺＋100 IU/ mL青鏈霉素＋10%NCS。

1.5 豬顆粒細胞體外培養的細胞形態學觀察

分離出顆粒細胞后，使用細胞培養液（DMEM（高糖）＋10%FBS＋2 mmol/L谷氨酰胺＋100 IU/mL青鏈霉素）調整細胞密度到1×106個/mL，每孔1 mL接種于 24孔培養板中，在 37℃，5% CO2，95%空氣，飽和濕度的培養箱中培養，分別于0，24，48 h觀察細胞生長狀態。

1.6 支原體檢測分析

吸除顆粒細胞培養液，PBS沖洗干凈，加入終濃度為50 μg/mL的DAPI熒光染色液，37℃，5% CO2，飽和濕度培養箱中染色30 min，去除處理液，PBS沖洗3～5次，去除未結合的DAPI，熒光顯微鏡下觀察。

1.7 顆粒細胞的生長曲線

選取第3代處于對數生長期的細胞，按照2× 104個/mL的密度接種于24孔培養板中，每孔接種1 mL。從接種時間算起，每隔24 h計數3孔內的細胞密度，算出平均值，共計7 d。以培養時間（d）為橫坐標、細胞密度為縱坐標作生長曲線。

1.8 數據統計分析

試驗數據以平均數±標準差（Mean±SD）表示，全部數據采用SPSS 17.0軟件包進行方差分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 豬顆粒細胞的分離

結果顯示，抽吸法和剖切法在分離每個卵巢顆粒細胞的時間上差異顯著（P＜0.05），但是在所得顆粒細胞的活率上差異不顯著（P＞0.05）（表1）。

表1 不同分離方法對分離顆粒細胞的影響

2.2 不同基礎培養基和血清對豬卵巢顆粒細胞體外培養的影響

結果顯示，基礎培養培養基TCM199與DMEM培養效果基本相同，有血清培養系統比無血清培養系統中顆粒細胞的貼壁速度快、大小均勻、生長狀態好，添加10%FBS的培養基中細胞的生長狀態較好，尤其是D＋10%FBS培養效果最佳（表2）。

表2 不同培養基對豬卵巢顆粒細胞體外培養形態的影響

2.3 豬顆粒細胞體外培養的細胞形態學觀察

結果顯示，懸浮在培養液中的顆粒細胞呈小圓球狀，也有的形狀不太規則（圖1-A）；培養12 h后部分顆粒細胞貼壁，未開始伸展（圖1-B）；培養24 h后豬顆粒細胞呈梭形或不規則狀貼壁生長（圖1-C）。顆粒細胞生長缺乏接觸性抑制，可形成聚集物或呈丘陵樣生長。

2.4 傳代培養的顆粒細胞支原體污染分析

結果顯示，傳第3代的豬顆粒細胞與熒光染料DAPI染色后，只觀察到細胞核發出藍色熒光，在細胞核和細胞膜之間看不到熒光，表明培養細胞沒有發生支原體污染（圖2）。

2.5 顆粒細胞的體外生長曲線

結果顯示，接種2 d后細胞數量開始明顯增加，第2～4天為對數生長期，第5～7天進入平臺期。體外培養的細胞呈現出“潛伏期—對數生長期—停滯期”的生長模式（圖3）。

3 討論

豬繁殖力高，且由于其來源方便、結構和生理與人類的相似及其在畜牧業中的重要地位等諸多優勢，使得豬卵巢顆粒細胞成為重要的細胞模型，相應的研究結果可以為人類生殖生理、病理、藥理和毒理研究提供良好的試驗基礎和借鑒，因此，建立完善的豬卵巢顆粒細胞分離培養系統非常重要。目前，豬卵巢顆粒細胞的分離主要有剖切法[6]和抽吸法[7]，分離效果還未有定論。本研究發現，在分離時間上剖切法顯著好于抽吸法，獲得細胞數量相對較大，但是二者獲得顆粒細胞的活率差異不顯著，表明2種方法各有優勢，如果試驗所需顆粒細胞數量大，可用剖切法，否則抽吸法比較簡單高效。

豬顆粒細胞培養的基礎培養基主要有DMEM[8]，DMEM/F12[9]，TCM199[10-11]和McCoy's 5A[12]等，其中最常見的是DMEM和TCM199，然而適宜豬卵巢顆粒細胞體外長期培養的基礎培養基還有待于進一步優選。另外，血清對體外培養的多種細胞的生長、增殖起重要的作用，而牛血清是細胞培養中最常用的天然培養基，也是應用最為廣泛的血清制品。本研究表明，單獨的基礎培養基培養，DMEM和TCM199培養效果都較差，添加血清是必要的，可明顯改善2種基礎培養基的效果，而且以DMEM和10%胎牛血清的互作效果最好。本研究血清的添加量以常用體細胞培養的10%添加，是否是最佳劑量還有待進一步研究。

懸浮狀態的豬顆粒細胞成明亮的球形，12 h后開始貼壁生長，24 h后呈梭形或不規則形狀貼壁生長，研究發現，部分顆粒細胞生長缺乏接觸性抑制，呈現丘陵樣集落生長，這與孫晉艷等[7]的研究結果相似。體外培養細胞的生長過程一般分為潛伏期、對數生長期和停滯期，本研究結果表明，培養的顆粒細胞存在早期生長延緩和晚期生長抑制的現象，符合貼壁細胞的一般生長規律，生長狀態良好，生長曲線顯示，顆粒細胞的對數生長期大約在第2～4天，這與朱麗等[6，13]的結果相似。

一般來講，由于環境條件限制或操作不嚴格，許多細胞系都存在支原體污染現象，導致傳代細胞生長緩慢，細胞形態不典型、空泡化和脂滴化等問題。顆粒細胞從卵巢采集到細胞分離進入培養箱，操作過程時間長、步驟多，很容易受到污染，尤其是光鏡下難以發現的支原體污染。支原體是介于細菌和病毒之間能獨立生活的最小微生物，是體外細胞培養中最常見且不易察覺的污染物[14]，污染物高達30%～60%[15]。常見的檢測方法是DNA熒光染色法和培養法[16]。本研究顯示，傳代培養的豬顆粒細胞只觀察到細胞核發出藍色熒光，在細胞核和細胞膜之間看不到熒光，表明培養細胞沒有發生支原體污染，驗證了培養條件的安全可靠。

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Isolation，Culture and Biological Characteristics of Porcine Ovarian Granulosa Cells

YANYibo，LI Wengang，JIAOFulin，WUZhijuan，HUGuangying，ZHOUShenghua，SUI Chao，YUE Lei，RENYifei
（Institute ofAnimal Husbandry&Veterinary，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030032，China）

Ovarian granulosa cells is an important cell model to study the mechanism of reproductive physiology,pathology, pharmacology and toxicology of female animals.The research adopted the method of conventional cell culture to establish the porcine ovarian granulosa cell culture system and study its biological characteristics.The results showed that suction method and split method each had their pros and cons,both had no significant effect on cell viability.The effect of serum was better than that of serum-free,and the effect offetal bovine serumwas better.The culture effect ofDMEMand TCM199 was similar,and the effect ofDMEM＋10%FBS was the best.Morphological observation showed that granulosa cells had the characteristics of adherent growth and lack of contact inhibition, the growth curve in vitro was consistent with the growth characteristics of adherent cells,DAPI fluorescence staining method did not detect mycoplasma contamination,the porcine ovarian granulosa cell grewwell.

pig;ovarian granulosa cells;isolation;cell culture

S828

A

1002-2481（2016）06-0825-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.06.26

2016-02-17

山西省自然科學基金項目（2013011029-4）；山西省農業科學院博士研究基金項目（YBSJJ1201）

閆益波（1979-），男，山西臨猗人，副研究員，博士，主要從事動物遺傳育種與繁殖學研究工作。李文剛為通信作者。