響應面法優化桑葚果渣中白藜蘆醇的提取工藝

陳瓊玲，薛霖莉，樊 迎，戴銘成

（山西農業大學信息學院，山西太谷030800）

響應面法優化桑葚果渣中白藜蘆醇的提取工藝

陳瓊玲，薛霖莉，樊 迎，戴銘成

（山西農業大學信息學院，山西太谷030800）

采用響應面法優化高壓提取桑葚果渣中白藜蘆醇的工藝條件。以白藜蘆醇提取量為考察指標，在單因素試驗的基礎上，采用Box-Benhnken中心組合設計3因素3水平試驗，以確定最佳提取參數。結果表明，最佳提取參數為：料液比1∶25（m/V）、乙醇濃度78%、提取壓力270 MPa、提取時間5.5 min；在此條件下，白藜蘆醇提取量可達（8.29±0.20）μg/g。

白藜蘆醇；桑葚果渣；響應面優化；提取

桑葚又名桑實、文武實、桑棗，為桑科植物桑的果穗[1]。成熟桑葚營養豐富，具有抗衰老、降血糖、增強機體免疫力、控制血糖升高、保護肝臟等多種功效[2-4]，被譽為“民間圣果”、“中華果王”[5]，國家衛生部將其列為“既是食品又是藥品”的農產品之一[6-7]。但由于桑葚鮮果采收期短且極易腐爛，難以長期貯存，目前多將其用于榨汁與釀酒，下腳料果渣大多被廢棄掉[8-9]。

白藜蘆醇作為存在于植物中的多酚化合物，具有較多生物活性，如抑菌消炎、預防癌癥、清除自由基、雌激素樣作用、抗艾滋病等，受到國內外學者的廣泛關注和深入研究[10-12]。目前，國內外用于提取白藜蘆醇的主要天然原材料為虎杖、花生根莖和紅衣、葡萄皮渣及籽粒等，但這些資源受地域、季節等條件限制，開發程度有限[13-16]。占鵬飛等[17]研究表明，桑資源中含有白藜蘆醇，且各部位含量依次為桑葚果渣＞根皮＞枝皮＞桑葉＞果汁。但目前對于桑葚果渣中白藜蘆醇提取工藝的研究少見報道。因此，研究桑葚果渣中白藜蘆醇的提取工藝，對于促進桑葚產業深加工，具有良好的經濟效益和較大的現實指導意義[18]。

本試驗以桑葚果渣為原料，采用高壓法提取白藜蘆醇，在單因素試驗基礎上，采用Box-Benhnken中心組合設計對提取條件進行優化，以確定最佳工藝參數，旨在為桑產業的副產品綜合利用提供借鑒和指導。

1 材料和方法

1.1 材料

桑葚采集于湖北省宜昌市桑葚產區。

1.2 試劑與儀器

白藜蘆醇標品為美國Sigma公司產品；無水乙醇（分析純）為國藥集團化學試劑有限公司產品；乙腈、冰醋酸（色譜純）為美國Fisher公司產品。

HPP.L2型超高壓處理裝置（華泰森淼有限公司）；LGJ-25C冷凍干燥機（北京四環科學儀器有限公司）；FDV粉碎機（日本佑崎有限公司）；MX5型微量電子天平（德國METTLER TOLEDO公司）；LXJ-ⅡB型低速大容量離心機（上海安亭科學儀器廠）；AS 200振動式篩分儀（德國Retsch公司）；1525型高效液相色譜儀（美國Waters公司）。

1.3 方法

1.3.1 白藜蘆醇提取方法 取新鮮桑葚洗凈瀝干，冷凍干燥后粉碎過篩（355 μm），備用。稱取5 g桑葚果渣置于塑料袋中，加入一定量的乙醇水溶液，塑封后置于高壓設備中提取一段時間。取出后于低速離心機中4 500 r/min離心10 min，取上清液測定體積（V），并采用高效液相色譜法（HPLC）測定其中白藜蘆醇的質量濃度（C）[11]。

計算白藜蘆醇的提取量m，即m（μg/g）＝CV/m0。式中，C為桑葚果渣提取液中白藜蘆醇的質量濃度（μg/mL）；V為提取液體積（mL）；m0為桑葚果渣總質量（g）。

1.3.2 單因素試驗 以白藜蘆醇提取量作為考察指標，依次研究料液比、乙醇濃度、提取壓力、提取時間等單因素對提取效果的影響，設計因素和水平如表1所示。單因素試驗的基本條件為：料液比1∶20，乙醇濃度80%，提取壓力200 MPa，提取時間3 min。

表1 單因素試驗因素和水平

1.3.3 Box-Benhnken中心組合設計（BBD）試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇乙醇濃度（X1）、提取壓力（X2）、提取時間（X3）進行3因素3水平Box-Benhnken中心組合試驗，以白藜蘆醇提取量為響應值。試驗因素的水平編碼及對應值列于表2。

表2 BBD因素水平

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對白藜蘆醇提取量的影響 由圖1可知，料液比太低時，原料與提取溶劑呈濃糊狀，難以提取與分離；隨著提取溶劑用量的增加，白藜蘆醇溶出量呈近似線性增加，當料液比達到1∶25時白藜蘆醇接近飽和溶出度；乙醇使用量繼續增加時，白藜蘆醇提取量保持水平，再無顯著增加。考慮到成本和后續分離純化，選擇料液比為1∶25。

2.1.2 乙醇濃度對白藜蘆醇提取量的影響 由圖2可知，隨著提取液中乙醇濃度增加，溶劑極性降低，白藜蘆醇提取量呈遞增趨勢，當乙醇濃度為80%時，提取量達最大值；當超過80%時，桑葚細胞中揮發油、磷脂等脂溶性的成分會競爭乙醇，導致藜蘆醇的提取量出現顯著下降趨勢。因此，提取溶劑選用75%～85%乙醇水溶液。

2.1.3 提取壓力對白藜蘆醇提取量的影響 由圖3可知，白藜蘆醇提取量隨壓力增大而增加，當壓力為250 MPa時，提取量達最大，可能是由于高壓會促進桑葚細胞壁破壞加深，促進了溶劑與白藜蘆醇的充分接觸[19]；但當壓力超過250 MPa時，白藜蘆醇提取量略有降低，因為壓力過高會導致桑葚果渣細胞徹底性粉碎，其他醇溶性雜質競爭提取溶劑，白藜蘆醇提取量逐漸下降。因此，確定提取壓力為200～300 MPa。

2.1.4 提取時間對白藜蘆醇提取量的影響 由圖4可知，高壓處理時間在1～5 min范圍內，隨著時間的延長提取量增加，時間延長會促進白藜蘆醇溶出；但當處理時間大于5 min時，提取量呈略降低的趨勢，可能是因為已溶出的白藜蘆醇出現氧化變性。因此，從節約能源和操作時間角度來看，選擇提取時間為4～6 min。

2.2 響應面試驗結果與數據分析

根據Box-Benhnken中心組合試驗設計原理，結合單因素試驗結果，固定料液比為1∶25，考察乙醇濃度（X1）、提取壓力（X2）、提取時間（X3）對提取量（Y）的影響。由SASv8.0專業版軟件設計出的試驗方案及結果如表3所示。

2.2.1 回歸模型的建立及檢驗 運用SAS軟件進行數據分析，在α＝0.05水平剔除不顯著項，得到多元二次回歸方程如下。

從表4可以看出，回歸模型F值為79.897 1，顯著性檢驗P＝0.000 1＜0.01，且失擬項檢驗P＝0.134 4＞0.05，表明失擬項差異不顯著。回歸模型相關系數R2＝0.993 1，調整系數AdjR2＝0.980 7，說明模型擬合程度很好，且總變異中只有1.93%不能用此模型解釋。綜上所述，可以認為所選用的二次回歸模型是適當的，未知因素對試驗結果干擾很小，所得到的方程能對響應值進行正確的預測。

表3 響應面試驗方案設計及結果

2.2.2 各因素的影響程度及交互作用 由表4可知，乙醇濃度、提取壓力和提取時間的一次項均達到極顯著水平（P＜0.01）；由F值可知，各因素對白藜蘆醇提取效果的影響程度大小依次為：提取壓力＞提取時間＞乙醇濃度；且二次項X12，X22，X32對回歸模型均達到極顯著影響，因此，各因素對白藜蘆醇提取量的影響不是簡單的線性關系。響應面所建立模型中，乙醇濃度與提取壓力以及提取壓力與提取時間之間有明顯的二次拋物線關系，交互作用顯著。

根據回歸方程做出對應的響應面和等高線（圖5，6）。2個交互作用的響應面都為開口向下的凸形曲面，即在試驗范圍內有白藜蘆醇提取量的極高值。由圖5可知，料液比為1∶25、提取時間為5 min時，X1X2交互作用曲面呈先增高后陡峭下降趨勢。中心點處即乙醇濃度（X1）為80%，提取壓力（X2）為250 MPa時，白藜蘆醇提取效果最好。

表4 回歸模型方差分析

由圖6可知，料液比為1∶25、乙醇濃度為80%時，隨著提取壓力和時間增加，桑葚果渣細胞壁破碎程度加劇，白藜蘆醇與提取溶劑充分接觸，溶出量逐漸增加；但提取壓力過大、提取時間過長時，一方面導致非極性雜質滲透出來，與提取溶劑發生作用，另一方面已溶出的白藜蘆醇本身性質不穩定，可能會發生氧化作用導致失活，所以白藜蘆醇提取量急劇下降。

2.2.3 提取條件的優化與驗證 在選取因素范圍內，通過SAS軟件分析得出理論最佳工藝參數為：乙醇波度78%、提取壓力271MPa、提取時間5.5 min，在此條件下，白藜蘆醇理論預測提取量為8.33 μg/g。考慮試驗操作的可行性，將壓力修正為270 MPa，其他參數不變。為證實結果的可靠性，在上述條件下，重復試驗3次，得到白藜蘆醇提取量為（8.29± 0.20）μg/g，與預測理論值相符，因此，此響應面得到的回歸模型具有一定的可靠性和實用價值。

3 結論

以桑葚果渣為原料，采用高壓法提取其中白藜蘆醇，探討料液比、乙醇濃度、提取壓力、提取時間等單因素對提取效果的影響。并通過Box-Benhnken中心組合試驗，確定白藜蘆醇最佳提取工藝為：乙醇濃度78%、料液比1∶25、提取壓力270 MPa、提取時間5.5 min，在此條件下，白藜蘆醇提取量達（8.29±0.20）μg/g。

［1］鄧義書.桑葚果渣多酚化合物提取純化及功能活性研究[D].上海：上海海洋大學，2010.

［2］王欣，王洪慶，康潔，等.桑葚的化學成分研究[J].藥學學報，2014，49（4）：504-506.

［3］Jia Z S.The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavengingeffects on superoxide radicals[J].Food Chemistry，1999，64（4）：555-558.

［4］成根杰.山西桑樹資源利用現狀及發展模式探討 [J].山西農業科學，2010，38（10）：70-73.

［5］肖更生，徐玉娟，劉學銘，等.桑葚的營養、保健功能及其加工利用[J].中藥材，2001，34（3）：5-8.

［6］劉朝良，孫輝，尹志亮，等.桑葚粗提取物中的有效活性物質分析[J].激光生物學報，2007，16（5）：547-551.

［7］應霞.果桑的主要特性和栽培技術[J].浙江農業科學，2009（4）：832-833.

［8］褚彥茹，張文娜，何建軍，等.桑葚果渣中紅色素的穩定性研究[J].食品研究與開發，2007，28（11）：59-61.

［9］廖李，姚晶晶，程薇.桑葚果渣可溶性膳食纖維提取工藝優化[J].湖北農業科學，2014，53（24）：6086-6089.

［10］AzizMH，Kunar R，Ahmad N.Cancer chemoprevention byresveratrol：In vitro and in vivo studies and the underlying mechanisms [J].International Journal ofOncology，2003，23：17-18.

［11］Pandey K B.Anti-oxidative action of resveratrol:Implications for human health[J].Arabian Journal ofChemistry，2011，4：293-298.

［12］代巧云，余秋波.白藜蘆醇的預防保健作用[J].現代預防醫學，2010，37（17）：3235-3236.

［13］陳瓊玲，劉紅芝，劉麗，等.高壓-微波法提取花生根中白藜蘆醇[J].食品科學，2013，34（20）：43-48.

［14］房祥軍，郜海燕，張俊，等.RP-HPLC法測定不同花生根中白藜蘆醇的含量[J].浙江農業科學，2009（4）：793-795.

［15］彭源德，朱作華，劉正初，等.酵母發酵虎杖提取白藜蘆醇技術初步研究[J].湖北農業科學，2011，50（23）：4929-4931.

［16］劉聃璐，林擁軍.葡萄白藜蘆醇合酶基因轉化水稻的研究[J].華中農業大學學報，2014，33（2）：8-14.

［17］占鵬飛，張燕，朱祥瑞.桑樹各部位中白藜蘆醇的提取與測定[J].蠶桑通報，2008，39（4）：19-22.

［18］蔡明，牟蘭，黃必志.我國蠶桑副產物的利用現狀·存在問題及相關對策[J].安徽農業科學，2013，41（18）：7969-7970.

［19］廖國平，賀帥，張忠義.均勻設計法優化超高壓提取虎杖中虎杖苷和白藜蘆醇[C]//2010年廣東省藥師周大會論文集.廣州：廣東省藥學會，2011.

Study on Optimization of Extraction Process of Resveratrol from Mulberry Pomace by Response Surface Methodology

CHENQiongling，XUE Linli，FANYing，DAI Mingcheng
（College ofInformation，Shanxi Agricultural University，Taigu 030800，China）

The response surface methodology was employed to optimize the extraction conditions of resveratrol from mulberry pomace by high pressure technology.The Box-Benhnken central composite design with three factors and three levels on the basis of single factors experiments was used to optimize the extraction conditions,taking resveratrol amount as response value.The results showed that the extraction amount could be up to（8.29±0.20）μg/gat the conditions as follows:rate ofsolution tosolid 1∶25（m/V）,ethanol concentration 78%,pressure 270 MPa with treatment time 5.5 min.

resveratrol;mulberrypomace;response surface optimization;extraction

TQ463＋.23

A

1002-2481（2016）06-0836-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.06.29

2016-03-29

陳瓊玲（1988-），女，湖北荊門人，助教，碩士，主要從事糧油加工與功能食品研究工作。