樟芝固態發酵產物抗氧化性分析

劉曉鳳， MmanywaMarim Said， 趙 慶， 羅先江， 廖軍藝，葛康杰， 石帥帥， 雀古拉·巴布提江， 艾連中， 夏永軍

上海理工大學醫療器械與食品學院，上海食品微生物工程技術研究中心，上海 200093

樟芝固態發酵產物抗氧化性分析

劉曉鳳， MmanywaMarim Said， 趙 慶， 羅先江， 廖軍藝，葛康杰， 石帥帥， 雀古拉·巴布提江， 艾連中， 夏永軍*

上海理工大學醫療器械與食品學院，上海食品微生物工程技術研究中心，上海 200093

本文對樟芝谷物固態發酵產物抗氧化性能及活性成分進行了研究。在所選谷物中，樟芝青稞固態發酵產物的乙醇提取物總抗氧化性最好，較未發酵青稞提高了4.02倍。通過無水乙醇50 ℃水浴振蕩提取80 min，其總抗氧化性達到了769.60 U/g。對其抗氧化性能分析發現，樟芝青稞固態發酵乙醇提取物為6 mg/L時，對DPPH自由基、羥基自由基以及超氧陰離子的去除率分別為91.9%、51.2%、61.3%，對鐵離子的螯合能力為79.5%。相對于未發酵谷物，大米、小米、玉米以及青稞的樟芝發酵產物中總酚含量均有顯著的提升，其中青稞乙醇提取和水提取物中總酚含量分別提高了2.36倍和4.23倍。通過HPLC分析可知，樟芝固態發酵產物含有豐富的活性化合物，包括馬來酸衍生物(Antrodin)以及泛醌類衍生物(Antroquinonol)，且各組分含量較為均衡；而樟芝液態發酵菌絲體乙醇提取物中主要活性成分為馬來酸衍生物，不含有泛醌類化合物。

樟芝； 固態發酵； 抗氧化； 總酚； 青稞

樟芝(Antrodiacamphorata)，又稱為牛樟芝、紅樟菇等，原產于臺灣地區的珍稀藥用真菌，早期臺灣原住民多用來治療飲酒所致的肝臟疾病以及食物中毒、過敏、腸胃不適等問題[1]。研究表明，樟芝可以作為潛在新藥的研發來源，含有多種生理活性成分，如活性多糖、三萜類化合物、固醇類化合物、苯環類化合物、多酚類化合物等，無論是樟芝子實體還是菌絲體產物，都具有非常好的保肝、抗癌等生理活性，許多學者的研究也證實了這一點[2-6]。

機體過度氧化是許多健康問題的主要引發原因，適當的抑制體內自由基的形成可以有效地緩解多種疾病。樟芝的抗氧化活性備受關注，許多學者對其液態發酵菌體和發酵液的抗氧化性能進行了研究。Song[7]等人研究顯示，樟芝液態發酵發酵液過濾組分能強烈地抑制脂質體過氧化，但是有機溶劑萃取組分抗氧化能力較弱。Hseu[8]等人研究發現樟芝菌體水提物可以有效地抑制由AAPH引發的紅細胞氧化性溶血和脂質體/蛋白的過氧化，并且可以阻止紅細胞內谷胱甘肽和ATP的損耗。

雖然樟芝菌絲體發酵產物中不含有麥角甾烷類三萜化合物，但是培養方式的改變同時也帶來不同的合成代謝途徑，使得樟芝發酵產物產生新的活性物質，這些活性物質同樣具有良好的生理活性。目前關于樟芝固態發酵產物的抗氧化研究較少，本文對比了樟芝不同谷物固態發酵產物的總抗氧化性能及總酚含量，分析了不同提取條件對總抗氧化性的影響，并對其自由基清除能力進行了研究，為開拓樟芝固態發酵產物的活性功能以及保健產品開發提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 菌株

樟芝S-29來源于實驗室，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC 9590。

1.2 培養基及培養條件

樟芝A.camphorataS-29菌株接種于PDA斜面，28 ℃避光培養9 d，于4 ℃保藏。

孢子懸浮液制備:取茄型瓶斜面，利用含有Tween 80(0.1% v/v)的無菌水25 mL洗下孢子，鏡檢孢子數達到1×108個/mL。

種子培養基:葡萄糖20 g/L，大豆蛋白胨4 g/L，檸檬酸0.5 g/L，MgSO40.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，pH 5.0。28 ℃，110 r/min培養4 d。

固態發酵培養基(1 L錐形瓶):谷物原料100 g，大豆蛋白胨0.4 g，MgSO40.5 g，KH2PO40.5 g，初始含水量70%(m/v)，初始pH 5.0。固態發酵接種量為30%(v/m)，28 ℃培養20 d。實驗選取大米、小米、玉米、青稞、黑米等谷物進行固態發酵。

液態發酵培養基：葡萄糖40 g/L，大豆蛋白胨6 g/L，MgSO40.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，pH 5.0。28 ℃，110 r/min培養8 d。

所有培養基均在115 ℃滅菌20 min。

1.3 樟芝固態發酵產物抗氧化性能分析

1.3.1 樟芝谷物發酵產物總酚含量的比較

將樟芝不同谷物發酵物粉碎，利用100目篩網過篩，得到發酵粉末。選用乙醇和水作為提取溶劑，分別稱取1 g發酵谷物粉末，放入20 mL提取溶劑中，40 ℃振蕩浸提1 h，測定提取液總酚含量，并以未發酵谷物提取物作為對照。

1.3.2 樟芝不同谷物發酵物抗氧化性比較

將樟芝不同谷物發酵物粉碎，利用100目篩網過篩，得到發酵粉末。選用乙醇和水作為提取溶劑，分別稱取1 g發酵谷物粉末，放入20 mL提取溶劑中，40 ℃振蕩浸提1 h，測定提取液總抗氧化性，并以未發酵谷物提取物作為對照。

1.3.3 不同提取溶劑萃取青稞發酵產物

將樟芝青稞固態發酵產物進行粉碎，利用100目篩網過篩，得到發酵粉末。實驗選取正己烷、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、乙醇作為提取溶劑進行實驗。稱取1 g發酵粉末，分別放入20 mL提取溶劑中，室溫振蕩浸提1 h，測定總抗氧化性，并以未發酵谷物提取物作為對照。1.3.4 乙醇濃度對樟芝固態發酵產物抗氧化性影響

將樟芝青稞固態發酵產物進行粉碎，利用100目篩網過篩，得到發酵粉末。實驗選取乙醇濃度分別為60%、70%、80%、90%、100%，稱取1 g發酵粉末，分別放入20 mL提取溶劑中，室溫振蕩浸提1 h，測定總抗氧化性。

1.3.5 乙醇萃取溫度對樟芝固態發酵產物抗氧化性影響

將樟芝青稞固態發酵產物進行粉碎，利用100目篩網過篩，得到發酵粉末。選取無水乙醇作為提取溶劑，稱取1 g谷物粉末，放入20 mL乙醇中，設定提取溫度為20 ℃～60 ℃，振蕩浸提1 h，測定總抗氧化性。

1.3.6 乙醇萃取時間對樟芝固態發酵產物抗氧化性影響

將樟芝青稞固態發酵產物進行粉碎，利用100目篩網過篩，得到發酵粉末。選取無水乙醇作為提取溶劑，稱取1 g谷物粉末，放入20 mL乙醇中，設定提取時間為60 min～120 min，測定總抗氧化性。

1.4 分析方法

1.4.1 總抗氧化性分析

樟芝發酵產物總抗氧化性(T-AOC)分析采用南京建成生物科技有限公司試劑盒。

1.4.2 總酚含量的測定

樟芝固態發酵產物總酚含量采用福林-酚法測定[9]。

1.4.3 樟芝固態發酵乙醇萃取物的制備

將10 g樟芝青稞固態發酵產物放置于容器中，按固液比1∶20加入無水乙醇，50 ℃水浴振蕩提取80 min，抽濾得到乙醇提取液。重復提取兩次，合并提取液，旋蒸濃縮至干，放置于4 ℃冰箱保存備用。

1.4.4 樟芝液態發酵菌絲體乙醇萃取物的制備

將10 g干燥后的樟芝液態發酵菌體粉碎后放置于容器中，按固液比1∶20加入無水乙醇，50 ℃水浴振蕩提取80 min，抽濾得到乙醇提取液。重復提取兩次，合并提取液，旋蒸濃縮至干，放置于4 ℃冰箱保存備用。

1.4.5 DPPH清除率[10]

分別取樟芝谷物發酵產物乙醇萃取物2 mg/mL和6 mg/mL各2 mL，加入1 mL DPPH溶液(0.2 mmol/L，以無水乙醇溶液溶解)，混合均勻，然后在室溫下遮光反應30 min后，然后在轉速6 000 r/min下離心10 min，取上層清液，最后在波長為517 nm處測定樣品的吸光度。空白組樣品以等體積的無水乙醇溶液代替0.2 mmol/L DPPH的無水乙醇溶液，對照組樣品以等體積相應溶劑代替谷物萃取液，并做3次平行。

1.4.6 清除HO-羥基能力[11]

在10 mL具塞試管中依次加入1 mL硫酸亞鐵溶液(5 mmol/L)，1 mL水楊酸-乙醇溶液(5 mmol/L)，1 mL過氧化氫溶液(3 mmol/L)混合均勻，然后自上述體系中加入樟芝谷物發酵產物乙醇萃取物2 mg/mL、6 mg/mL各2 mL，用雙蒸水補齊至刻度，在37 ℃的恒溫水浴中反應15 min，然后再轉速6 000 r/min離心10 min，以雙蒸水做參比，在波長510 nm下測定吸光度，吸光值數據平行測定3次。

1.4.7 超氧陰離子自由基清除率[12]

取0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.2)4.5 mL，置于25 ℃水浴中預熱20 min，分別加入樟芝谷物發酵產物乙醇萃取物2 mg/mL、6 mg/mL 各2 mL和0.1 mL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液(以10 mmol/L鹽酸配制，調零管取用10 mmol/L鹽酸代替鄰苯三酚的鹽酸溶液)，混勻后于25 ℃水浴中反應5 min，加入1 mL 8 mol/L鹽酸終止反應，325 nm處測定吸光度。空白對照組以雙蒸水代替樣品液。

1.4.8 亞鐵離子螯合能力[13]

分別樟芝谷物發酵產物乙醇萃取物2 mg/mL和6 mg/mL各2 mL與0.1 mL抗壞血酸溶液(10 g/L)，0.1 mL硫酸亞鐵溶液(4 g/L)和1 mL氫氧化鈉溶液(0.2 mol/L)混合，在37 ℃水浴中孵育20 min然后加入0.2 mL三氯乙酸(10%)，經離心10 min得上層清液，加入0.5 mL鄰菲羅啉(1 g/L)溶液，反應10 min后，在510 nm波長下測定吸光度。(以雙蒸水作為空白對照)調零用雙蒸水調零。

1.4.9 HPLC分析方法

樟芝固態發酵產物HPLC分析條件如下：色譜柱，Sepax HP C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流速：1 mL/min；檢測波長：254 nm；流動相A：水/TFA=100/0.5，流動相B：乙腈；洗脫梯度如下：0 min～4 min，流動相B 35%～57%；4 min～10 min，流動相B 57%～70%；10 min～15 min，流動相B 70%～90%；15 min～18 min，流動相B 90%～100%；18 min～28 min，流動相B 100%～35%。

1.5 數據統計分析

每個實驗重復三次，數據采用SPSS 19.0統計軟件對數據進行處理，實驗結果以均值±標準偏差(Mean+SD)表示。

2 結果與討論

2.1 樟芝固態發酵產物總酚含量分析

天然多酚化合物由于含有多羥基基團，具有良好的抗氧化活性。如圖1所示，樟芝固態發酵產物中含有豐富的多酚類化合物。經過樟芝發酵，大米、小米、玉米以及青稞的乙醇提取液總酚含量均有顯著的提升，其中青稞發酵產物總酚含量最高，達到了5.82 mg/g，較未發酵青稞提高了2.36倍。在水提物中，樟芝固態發酵產物的總酚含量依次為小米>青稞>玉米>大米，其中小米與青稞的總酚含量分別為8.61 mg/g、8.26 mg/g。然而，在大米、小米與玉米的未發酵谷物幾乎沒有檢測到多酚類化合物。有趣的是，經過樟芝發酵，無論是乙醇提取液還是水提液中，黑米中的總酚含量有明顯的下降，為所選谷物中總酚含量最低的樣品，其中乙醇提取總酚含量為1.96 mg/g，較未發酵黑米降低了43%。這可能是樟芝發酵過程中會對黑米中的花青素進行利用降解，從而導致總酚含量有所降低。實驗結果可知樟芝發酵谷物可以顯著提高谷物中總酚類化合物的含量。

A：乙醇提取；B：水提取圖1 樟芝固態發酵產物總酚含量分析

2.2 樟芝不同谷物發酵抗氧化性能分析

樟芝在實驗所選谷物上均生長良好，其中青稞、大米生長較快，小米生長較慢。如圖2所示，樟芝不同谷物發酵抗氧化性有較大差異。在所選谷物中青稞發酵產物乙醇提取物總抗氧化活性最高，達到了772.07 U/g，比Vc參照組總抗氧化值高出了56.50%，相當于1.69 mmol/L的Vc；黑米發酵產物其次，為762.20 U/g；大米和小米發酵產物總抗氧化性較低，均在300 U/g以下(圖2B)。如圖1A所示，熱水提取的樟芝谷物固態發酵產物總抗氧化性較乙醇提取物低，其中最高的為青稞發酵產物，僅有426.11 U/g；但是與其他谷物不同的是，小米發酵的水提物總抗氧化性高于乙醇提取物，兩者相差達到1.78倍。因此，后續實驗選取青稞作為固態發酵原料。

A：水提取；B：乙醇提取圖2 樟芝不同谷物固態發酵產物總抗氧化性分析

2.3 不同有機溶劑萃取抗氧化性能分析

不同溶劑的極性不同，因此所提取的化合物種類有一定差異，本實驗選取了不同的有機溶劑對樟芝青稞發酵產物總抗氧化性能進行分析，實驗結果如圖3所示。結果顯示乙醇提取液的總抗氧性最好，達到了757.27 U/g，丙酮提取液總抗氧化性其次，僅有357.67 U/g。乙醇作為提取劑，能夠誘導非極性化合物產生一定的偶極矩，令其產生一定的極性，從而增加溶解度，同時對青稞發酵產物的穿透力強，成分提取比較全面且使用安全，因此，后續實驗選用乙醇作為提取溶劑。

圖3 不同提取溶劑對樟芝青稞發酵產物總抗氧化性的影響

2.4 乙醇濃度對樟芝固態發酵產物抗氧化性影響

不同濃度乙醇溶液提取樟芝青稞固態發酵物的抗氧化活性結果如圖4所示。當乙醇濃度較低時(60%～80%)，乙醇提取液的總抗氧化性變化幅度較小，且處于較低水平；當乙醇濃度進一步提高(80%～100%)，乙醇提取液的總抗氧化性迅速增加，在100%乙醇提取時達到最高。

圖4 乙醇濃度對樟芝固態發酵產物抗氧化性影響

2.5 提取溫度及提取時間對樟芝固態發酵產物抗氧化性影響

圖5顯示了提取溫度和時間對樟芝固態發酵產物抗氧化性影響。提取溫度及時間會影響活性成分在提取溶劑中的擴散作用以及穩定性。如圖5A所示，溫度對乙醇提取液總抗氧化性有顯著影響。在40 ℃～60 ℃之間，總抗氧化性沒有顯著差異，其中50 ℃時總抗氧化值達到730.17 U/g，說明在實驗選擇溫度范圍內，乙醇提取物的溫度穩定性較好；當提取溫度為20 ℃時，提取液的總抗氧化性迅速下降，僅有140.16 U/g，降低了80.74%。如圖5B所示，隨著提取時間的延長，樟芝青稞發酵產物乙醇提取液的總抗氧化性逐漸提高，當提取時間為80 min時達到最大，高達769.60 U/g，隨著溫度繼續上升，總抗氧化性稍有下降。因此，后續實驗選擇提取溫度為50 ℃、提取時間為80 min。

A：提取溫度；B：提取時間圖5 提取溫度及提取時間對樟芝青稞發酵產物總抗氧化性的影響

2.6 樟芝青稞固態發酵產物抗氧化性能評價

自由基等會造成機體組織過氧化、核酸與蛋白質解聚斷裂，對機體健康有著極大的損害。對自由基的清除效果是反應抗氧化能力的重要指標。如圖6A所示，樟芝青稞固態發酵產物具有較好的清除自由基能力。當濃度為乙醇提取物濃度為6 mg/L時，DPPH自由基清除效率達到了91.9%，通過標曲換算相當于4.48 mmol/L的Vc；羥基自由基和超氧陰離子的清除率也分別達到了51.2%和63.3%。對樟芝固態發酵產物鐵離子螯合能力研究發現，隨著乙醇提取物濃度提高，螯合能力逐漸提高，當6 mg/L時達到了79.5%。樟芝液態發酵菌絲體乙醇提取物也具有較好的抗氧化性，但自由基清除能力較固態發酵產物低(圖6B)。

A：固態發酵產物；B液態發酵產物圖6 樟芝菌絲體發酵產物抗氧化性能對比

2.7 樟芝發酵產物HPLC分析

樟芝主要有三種人工培養方式：牛樟樹椴木栽培法、固態發酵法、深層液態發酵法，第一種得到的是子實體，后兩種得到的是菌絲體或其混合物。目前，樟芝菌絲體培養是有效的大規模人工培養方式。如圖7所示，樟芝青稞固態發酵乙醇提取物中含有豐富的活性化合物，包括馬來酸衍生物(Antrodin A、C)以及泛醌類衍生物(Antroquinonol、Antroquinonol B)，而樟芝液態發酵菌絲體乙醇提取物中主要活性成分為馬來酸衍生物(Antrodin A、C)，不含有泛醌類化合物[14]。

3 結論

本文對樟芝固態發酵產物相關成分進行了測定，并對比評價其抗氧化性能。結果顯示，通過樟芝固態發酵，發酵產物中的總酚含量以及清除自由基等抗氧化性能均有顯著的提高。在實驗所選谷物中，樟芝青稞固態發酵產物抗氧化性能最好，其乙醇提取和水提取物中總酚含量較未發酵谷物分別提高了2.36倍和4.23倍，總抗氧化能力分別提高了2.19倍和4.02倍。樟芝青稞固態發酵產物的自由基清除能力以及鐵離子螯合能力均好于液態發酵菌體提取物，而且從活性成分分析可知，樟芝青稞固態發酵乙醇提取物中含有豐富的活性化合物，且各組分含量較為均衡；而樟芝液態發酵菌絲體乙醇提取物中活性成分較為單一。由此可知，樟芝固態發酵產物在抗氧化方面具有較好的潛力，需要進一步對其抗氧化活性成分進行鑒定，并且研究其對細胞組織氧化應激損傷的保護作用。

A：液態發酵；B：固態發酵1：Antroquinonol B; 2：Antrodin C; 3：Antrodin A; 4：Antroquinonol圖7 樟芝發酵產品HPLC分析圖

[1] Wu SH, Ryvarden L, Chang TT.Antrodiacamphorata(“niu-chang-chih”), new combination on medicinal fungus in Taiwan[J]. Bot Bull Acad Sinica,1996, 38(4): 273-275.

[2] Shao YY, Chen CC, Wang HY. Chemical constituents ofAntrodiacamphoratasubmerged whole broth[J]. Nat Prod Res, 2008, 22(13): 1151-1157.

[3] Chang JS, Kuo HP, Chang KL,etal. Apoptosis of hepatocellular carcinoma cells induced by nanoencapsulated polysaccharides Extracted fromAntrodiacamphorata[J]. PloS One, 2015, 10(9):e0136782.

[4] Qiao X, Wang Q, Ji S,etal. Metabolites identification and multi-component pharmacokinetics of ergostane and lanostane triterpenoids in the anticancer mushroomAntrodiacinnamomea[J]. J Pharm Biomed Anal, 2015, 111: 266-276.

[5] Kumar KJ, Vani MG, Chueh PJ,etal. Antrodin C inhibits epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis of breast cancer cells via suppression of smad2/3 and β-catenin signaling pathways[J]. PloS One, 2015, 10(2):e0117111.

[6] Yen IC, Yao CW, Kuo MT,etal. Anti-cancer agents derived from solid-state fermentedAntrodiacamphoratamycelium[J]. Fitoterapia, 2015, 102:115-119.

[7] Sond TY, Yen GC. Antioxidant properties ofAntrodiacamphoratain submerged culture[J]. J Agric Food Chem, 2002, 50(11): 3322-3327.

[8] Hseu YC, Chang WC, Hseu YT,etal. Protection of oxidative damage by aqueous extract fromAntrodiacamphorata, mycelia in normal human erythrocytes[J]. Life Sci, 2002, 71(4): 469-482.

[9] Singleton VL, Rossi JA. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic phosphotungstic acid reagents[J].Am J EnolVitic,1964, 16: 144-158.

[10] Shimada K, Fujikawa K, Yahara K,etal. Antioxidative properties of xanthan on the autoxidation of soybean oil in cyclodextrin emulsion[J]. J Agric Food Chem, 1992, 40(6): 945-948.

[11] Liu F, Ooi VE, Chang ST. Free radical scavenging activities of mushroom polysaccharide extracts[J]. Life Sci, 1997, 60(10): 763-771.

[12] Nishikimi M, Appaji N, Yagi K. The Occurrence of Superoxide Anion in the Reaction of Reduced Phenazine Methosulfate and Molecular oxygen[J].Biochem Biophys Res Commun, 1972, 46(2): 849-854.

[13] Decker EA, Welch B. Role of Ferritin as a Lipid Oxidation Catalyst in Muscle Food. J Agric Food Chem, 1990, 38(3): 674-677.

[14] 夏永軍. 樟芝菌發酵生產Antrodins等活性產物的研究[學位論文]. 出版地:無錫，出版者: 江南大學，出版年 2012.

Antioxidant of Antrodia camphorata by solid state fermentation

LIU Xiao-feng, MmanywaMarim Said, ZHAO Qing, LUO Xian-jiang, LIAO Jun-yi, GE Kang-jie, SHI Shuai-shuai, Xugla Bamutjan, AI Lian-zhong, XIA Yong-jun

School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai Engineering Research Center of Food Microbiology, Shanghai, 200093

The antioxidant and bioactive compounds ofAntrodiacamphorataby solid state fermentation (SSF) were investigated. Results showed that the ethanol extract of fermented highland barley had the highest antioxidant activity with 4.02 times than that of the unfermented highland barley. The antioxidant activity could reach up to 769.60 U/g under the extracting conditions: ethanol 100%, temperature 50℃, extracting time 80 min. When concentration of ethanol extract was 6 mg/g, free radical scavenging activity for DPPH radical, hydroxyl free radicals, superoxide anion were 91.9%, 51.2%, 61.3% respectively; and the chelating effects of ethanol extract on ferrous ions was 79.5%. The total phenolic contents of fermented grains, such as rice, millet, corn and highland barley were increased significantly than those of unfermented grains. There were 2.36, 4.23 times increasing for the fermented highland barley extracted by ethanol and water, respectively. In SSF,Antrodiacamphoratacould synthesize more bioactive compounds than in liquid state fermentation (LSF), including antrodin and antroquinonol. However, there was no antroquinonol produced in LSF.

Antrodiacamphorata; solid state fermentation; antioxidant activity; total phenolic; highland barley

10.3969/j.issn.1001-6678.2016.06.006

上海市自然科學基金項目(15ZR1428900)；上海市大學生創新創業訓練計劃項目(201510252146)；滬江基金研究基地專項(D15012)。

劉曉鳳(1991～)，女，碩士，食品微生物資源開發及利用。E-mail：18354286623@163.com。

*通信作者：夏永軍(1981～)，男，講師，博士，食品生物技術。E-mail：dreamup@126.com。