培養細胞體系中槐定堿抗EV71病毒的作用

歐陽劉健，魏昌瑛

（杭州第二中學高三611班（實驗班），浙江 杭州 310053）

培養細胞體系中槐定堿抗EV71病毒的作用

歐陽劉健，魏昌瑛△

（杭州第二中學高三611班（實驗班），浙江 杭州 310053）

探究槐定堿抗EV71病毒的作用，為防治手足口病提供線索。在體外培養的Vero細胞體系中加入槐定堿，用MTT法檢測其細胞毒性；在病毒感染的不同時期用槐定堿處理，用MTT法檢測細胞存活率、細胞病變等指標，表征其對EV71病毒吸附、穿入的抑制作用及直接殺滅作用；用RT-PCR法檢測其對于病毒RNA復制的抑制作用。（1）槐定堿具有一定細胞毒性，其CC50為1.414mg/mL；（2）能夠抑制病毒對Vero細胞的感染，其IC50＝0.354mg/ mL；（3）其機制可能是抑制病毒的吸附和RNA復制，但對病毒穿入的抑制作用較弱。槐定堿可抑制病毒吸附和病毒增殖，在病毒感染前后用藥效果都較好，且有效濃度遠小于其CC50值，作為防治手足口病藥物的開發潛力較大。

Vero細胞，槐定堿，抑制，EV71病毒。

1 概述

手足口病 （Hand,foot and mouth disease，HFMD）是一種常見的病毒性傳染病，易感人群多為學齡前兒童，尤以3歲以下發病率最高［1］。腸道病毒71型（enterovirus71，EV71）可感染T淋巴細胞、人血管內皮細胞和神經細胞，觸發細胞凋亡［2～4］，引起持續高熱，導致中樞神經系統疾病及并發癥［5］，致殘和死亡率較高［6］，是造成HMFD疾病的主要病原體［7］。因此引起全球廣泛關注。

EV71是單股正鏈RNA病毒，屬于小RNA病毒科腸道病毒屬A組［8］。該病毒侵染細胞時，首先與細胞上的受體（CD55等）結合，吸附在細胞膜上并脫去蛋白質衣殼，其RNA基因組進入細胞，并立即進行蛋白的翻譯加工，產生成為新的衣殼蛋白；同時在病毒RNA聚合酶的作用下生成負鏈RNA，再以負鏈RNA為模板生成新的正鏈RNA；在感染晚期組裝形成子代病毒，裂解細胞釋放出病毒顆粒［9］，并進一步感染相鄰細胞。感染EV7l后1-2h，細胞自身的大分子合成迅速停止，染色質邊緣化；感染3h后，胞質空泡化，病毒蛋白質合成開始；4h后質膜通透性增大；6h后病毒在胞質內合成；10h后細胞裂解，病毒顆粒釋放。細胞裂解時出現的細胞形態學改變，稱致細胞病變效應（CPE）。典型的細胞CPE表現為細胞圓縮，分散，胞漿內顆粒增加，折光性增強，直至細胞從培養板上脫落，細胞漂起。溫度、pH、宿主細胞、感染的多樣性等因素都會影響病毒的感染和復制。

目前，在抗EV71病毒藥物的研發聚焦于利用現有的抗病毒藥物、設計抗病毒藥物的衍生物和篩選新的抗病毒藥物等方面。Chem等發現吡唑啉［3,4-d］嘧啶類物質在低濃度下對EV71有抑制作用［10］。Liu等發現I型干擾素可能對控制EV71感染起重要作用［11］。Sim等用針對EV71基因組的小干擾RNAr（siRNA）作用于病毒，可顯著減輕體外培養的EV71感染細胞病變［12］。Tan等發現一種化學合成的短發卡樣RNA（shRNA）可顯著抑制培養細胞內EV71的復制［13］。但這些成果大多停留在實驗室階段，能否應用于臨床尚有待研究。

槐定堿（Sophoridine）是苦豆子、苦參的主要活性成分之一，可增強正常小鼠巨噬細胞功能，并促進脾臟免疫細胞增殖［21］。在一定劑量范圍內，槐定堿能劑量依賴性地抑制巨噬細胞經LPS刺激產生TNF-α，這可能是其抗炎、免疫調節作用的機制之一［14］。江西中醫藥大學李雪梅組獨立研制成功了抗癌新藥槐定堿及其制劑“鹽酸槐定堿注射液”，獲國家一類化學新藥證書和生產證書，獲江西省2007年度科學技術進步獎一等獎（據江西中醫藥大學新聞，http://news.j xutcm.edu.cn/info/1002/14917.htm）。本研究以EV71敏感的Vero細胞為模型，研究槐定堿是否具有抗EV71病毒的作用，探討其臨床應用的可行性，為尋找治療手足口病的新藥物提供線索。

2 實驗材料與方法

2.1 實驗材料

Vero細胞購自中科院生物化學與細胞生物學研究所；EV71病毒株由邯鄲市疾病預防與控制中心惠贈；DMEM培養基、胰蛋白酶、雙抗、胎牛血清（FBS）購自Gibco公司；槐定堿購自蘇州寶澤堂醫藥有限公司；TaqDNA聚合酶購自Fermentas公司；TrizolReagent購自Takara公司；cDNA反轉錄試劑盒購自TOYOBA公司；EV71和18sPCR引物由上海捷瑞生物技術服務有限公司合成，其序列見表1。

表1 所用EV71和18S引物序列

2.2 實驗方法

2.2.1 Vero細胞的培養與計數方法

取液氮凍存的Vero細胞管，置于42℃水浴中迅速解凍，低速離心后吸出上清液，用完全培養液（DMEM培養基中加入1%青霉素和鏈霉素，10% FBS）吹起后移入細胞培養瓶或培養板中，在CO2濃度5%、37℃條件下培養12h，吸出原培養液，PBS沖洗3次；加入等量新鮮培養液繼續培養，觀察細胞的生長狀態。當細胞匯合率達90%左右時，吸出原培養液，用D-Hanks緩沖液沖洗3次，加入2.5%胰蛋白酶-EDTA，37℃消化2min，輕輕吹打使細胞脫離培養瓶壁，加入等量完全培養液終止消化，于800～1000rpm下離心5min；吸去上清液，加入5mL完全培養液，使細胞懸浮并充分分散，平均分裝到2-3個新的細胞培養瓶中，補充培養液至適量體積，在37℃、5%CO2條件下進行傳代培養。采用血球計數板計數法計數細胞，細胞濃度＝四大格中的細胞總數×稀釋倍數/4。

2.2.2 EV71病毒的培養、檢測和TCID50測定

EV7l病毒株用無血清DMEM進行10倍比梯度稀釋；接種于96孔板中的Vero細胞（5×103/孔）生長至90%左右 （約10h）時，加入不同稀釋度的EV71病毒稀釋液50μL，每個梯度重復8孔，以未加病毒的細胞作為陰性對照。于37℃，5%CO2條件下培養7d，期間連續觀察細胞病變，統計細胞完全病變的孔數。按Behrens-Karber公式計算病毒滴度TCID50：logTCID50＝L-d（S-0.5），其中：L＝實驗中使用的最低稀釋度的log值；D＝稀釋梯度的log值；S＝出現CPE的細胞孔所占的比例之和。

當CPE達75%以上時收取病毒裂解液，提取病毒RNA，用RT-PCR法檢測。反應體積為20μL，反應條件為95℃預變性3min；95℃變性20s，45℃退火25s，72℃延伸30s，30個循環；后72℃延伸10min；目的片段預期長度為226bp。以18sRNA作為內標，反應條件為94℃預變性5min;94℃變性30s，58℃退火 30s，72℃延伸 45s，30個循環；后 72℃延伸10min。反應結束后，取10μLPCR反應產物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段。

◎23價疫苗：2歲以上有基礎疾病（比如艾滋，腎炎啥的免疫力低下）的兒童才打，正常的健康寶寶不要打，有報道正常兒童打過幾年后反而會對肺炎球菌的免疫有問題。

2.2.3 槐定堿的細胞毒性檢測

接種Vero細胞（1×105個/mL）于96孔板，每孔100μl，培養24h，吸去原培養液，加入含有不同濃度槐定堿（0.015、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL）的維持培養液，以未加化合物組的培養細胞組為陰性對照，以DMEM培養液為空白對照。每個濃度3復孔。各組均在37℃、5%CO2條件下孵育48h后，去除培養液，加入DMSO150μL，輕輕震蕩以溶解結晶，用酶標儀測定490nm處吸光度值（A490），計算細胞存活率（%）。

2.2.4 槐定堿在不同侵染時期的抗病毒作用

接種Vero細胞于96孔板（1×105個/mL，每孔100μl）中，培養24h后分為6組。組Ⅰ：加入病毒，同時加入槐定堿（0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1mg/mL）。并據本組數據計算槐定堿對于EV71病毒的半抑制濃度（IC50）；組Ⅱ：將病毒與槐定堿混合后于37℃作用2h，隨后重懸病毒加入96孔板中；組Ⅲ：加入病毒并吸附2h后，吸去病毒液并加入槐定堿；組Ⅳ：用槐定堿預處理細胞2h后，加入病毒；組Ⅴ：空白對照組（不做任何添加）；組Ⅵ：陰性對照組（加入病毒，不加藥物處理）。各組細胞繼續培養48h后吸盡培養液，每孔加入5mg/mL的MTT溶液10μl，37℃下繼續孵育4h，小心去除培養液，參照2.2.3測定其A490，計算細胞存活率（%）。除組Ⅰ外各組的毒量均按IC50加入，每濃度重復3孔。

2.2.5 槐定堿對病毒吸附、穿入及RNA復制的抑制實驗

參照2.2.4的方法細胞培養24h后分為三組：組Ⅶ：置于4℃預冷1h，加入EV71病毒，隨即加入含有槐定堿（濃度同2.2.4）的維持培養液，4℃靜置孵育3h，棄去全部培養液，用PBS沖洗3次以去除尚未吸附的病毒，加入完全培養液；組Ⅷ：將96孔板在4℃預冷1h并加入病毒，繼續靜置3h，隨即加入含有不同濃度槐定堿（濃度同2.2.3）的維持培養液，置于37℃培養，使病毒最大限度穿入細胞。每10min為間隔，以pH11的PBS沖洗細胞以終止病毒穿入，隨后立即加入pH3的PBS沖洗細胞以中和堿性PBS，加入完全培養液；組Ⅸ：處理與2.2.4中組Ⅳ相同。空白對照和陰性對照組與2.3.4相同。各組均繼續培養48h，第Ⅶ、Ⅷ兩組參照2.2.3用MTT法測定A490，計算細胞存活率；第Ⅸ組用RT-PCR法半定量檢測EV71病毒RNA（參照2.2.2），每個濃度重復3孔。

2.2.6 數據處理

數據均用GraphpadPrism5.0軟件處理。并用單因素方差分析法進行統計和誤差分析。

3 結果與分析

正常Vero細胞的形態如圖1（A）所示，EV71病毒感染引發的細胞CPE反應如圖1（B）所示，病毒基因組RT-PCR結果如圖1（C）所示。被病毒感染的細胞表現為圓縮、分散、胞漿內顆粒增加、折光性增強、從培養板上脫落漂起等征狀。經PCR擴增得到了EV71病毒特有的226bp條帶。用Behrens-Karber法計算出該病毒株的 TCID50值為 1×10-4.25/100μL，即病毒液稀釋104.25倍后，每孔添加100μl可引起50%的細胞產生CPE反應。即病毒滴度為1×105.25TCID50/mL，在此滴度下Vero細胞被病毒感染48h后可完全漂浮。

圖1 EV71病毒導致的Vero細胞CPE反應（40×）及病毒基因組檢測結果

3.2 槐定堿對于Vero細胞的毒性

由圖2可見：細胞存活率隨著槐定堿濃度的增加逐漸降低，說明槐定堿具有一定的細胞毒性。濃度低于31.25μg/mL時，對Vero細胞損傷較小（～10%）；濃度達到2mg/mL時仍有約10%細胞存活。計算出槐定堿對于Vero細胞的CC50為1.414mg/mL。

圖2 槐定堿對Vero細胞的毒性作用（N=3）

3.3 槐定堿不同處理對EV71病毒的抑制作用

槐定堿對EV71病毒感染后細胞CPE反應的抑制作用參如圖3（A～C）所示。在感染的不同時期給藥（第Ⅰ～Ⅳ組）對病毒抑制（對細胞保護）的檢測結果參如圖3（D～G）所示（N＝3）。

圖3 槐定堿不同處理對EV71病毒的作用

3.4 槐定堿對EV71病毒吸附、穿入和復制的抑制作用

病毒危害細胞的過程大致可以分為吸附、穿入和復制。圖4-A（組Ⅶ）顯示：31.25μg/mL的槐定堿對于病毒吸附即具有較好的抑制作用（p＜0.001），且抑制作用與濃度正相關。圖4-B（組Ⅷ）顯示槐定堿對病毒穿入的抑制作用較弱。圖4-B（組Ⅸ）顯示：較低濃度槐定堿（62.5μg/mL）對于病毒RNA復制即具有明顯的抑制作用，其抑制作用與濃度正相關。

圖4 槐定堿對EV71病毒吸附、穿入和復制的抑制作用

4 討論與結論

Vero細胞是非洲綠猴腎細胞，對EV71病毒感染較為敏感，以成為病毒學研究的常用細胞體系。我們選用體外培養的Vero細胞體系，探究了槐定堿抗EV71病毒的作用，并對其抗EV71病毒的機制進行了初步探討。盡管培養細胞體系中的實驗結果與臨床還有相當距離，但也為該藥物的臨床應用提供了有益的線索。

中藥及其提取物的抗EV71病毒已有許多相關研究，見表2。本研究發現：槐定堿可有效抑制EV71病毒對 Vero細胞的感染，其 IC50值為0.35mg/mL，該值優于丹參提取液的IC50值。而槐定堿對于 Vero細胞的半致死濃度 （CC50值）為1.346mg/mL，遠高于IC50值，說明該藥物細胞毒性較低，而安全性較高。

表2 部分抗EV71病毒藥物的IC50值

EV71病毒感染細胞大致包括病毒吸附、脫衣殼、病毒遺傳物質進入細胞（穿入）、病毒RNA復制、衣殼蛋白合成和病毒組裝等關鍵步驟。這些關鍵的步驟都可成為抗病毒化合物研究的作用靶點［22］。本研究主要就病毒吸附、穿入及復制三個方面初步探究了槐定堿抑制EV71病毒對Vero細胞感染的機制。結果表明：低濃度（31.25μg/mL）的槐定堿即可抑制EV71病毒的吸附，而較高濃度（62.5μg/mL以上）的槐定堿還可以抑制病毒RNA的復制。劉曉玲等的研究表明：槐定堿等苦參系列生物堿可有效抑制柯薩奇B3病毒(CVB3)所致的Vero細胞和大鼠原代心肌細胞病變抑制作用、病毒繁殖抑制反應［23］。我們的結果與劉曉玲等的研究結果能夠相互印證。

根據本實驗可得出如下結論：在體外，槐定堿在病毒感染早期具有較好的抗病毒作用，在感染后期對EV71的復制也具有較強的抑制作用。說明該化合物可能具有一定的預防和治療作用，作為抗EV71病毒藥物的開發潛力較大。

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：魏昌瑛，男，指導老師。Email:512667205@qq.com.