利多卡因?qū)w外培養(yǎng)軟骨細胞分泌Ⅱ型膠原和蛋白多糖的影響

楊朝暉

(山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院骨科，山西 太原 030001)

實驗研究

利多卡因?qū)w外培養(yǎng)軟骨細胞分泌Ⅱ型膠原和蛋白多糖的影響

楊朝暉

(山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院骨科，山西 太原 030001)

目的 通過測定一定濃度、不同作用時限下利多卡因?qū)w外培養(yǎng)軟骨細胞分泌Ⅱ型膠原和蛋白多糖的影響，探求利多卡因臨床常用濃度的安全性，以期為臨床應(yīng)用提供借鑒。方法 2月齡新西蘭大白兔6 只，隨機分組，空氣栓塞處死。無菌手術(shù)切取雙膝關(guān)節(jié)軟骨，分離、培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨細胞。2 mmoL/L利多卡因分別干預軟骨細胞3 d、6 d、9 d，RT-PCR檢測軟骨細胞內(nèi)Ⅱ型膠原、蛋白多糖mRNA的表達。并對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。結(jié)果 2 mmoL/L利多卡因干預軟骨細胞，Ⅱ型膠原mRNA的表達第3﹑6﹑9天分別為(18.51±2.34)﹑(16.95±3.10)﹑(15.79±3.57)較對照組(19.48±4.01)(18.76±1.96)(17.81±3.05)均無統(tǒng)計學差異，t值分別為(-0.32﹑-0.45﹑-0.72)(P>0.05)；第3﹑6﹑9天蛋白多糖mRNA的表達分別為(9.72±0.32)﹑(9.59±0.78)﹑(12.54±1.06)較對照組(10.68±1.07)﹑(10.06±0.93)﹑(9.87±1.12)相比，第3﹑6天t值分別為(-0.82﹑-0.76)(P>0.05)；第9天(t=2.59，P<0.05)。結(jié)論 常用劑量、濃度的利多卡因關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射對關(guān)節(jié)軟骨分泌Ⅱ型膠原和蛋白多糖無明顯影響。

軟骨細胞；利多卡因；Ⅱ型膠原；蛋白多糖

關(guān)節(jié)鏡手術(shù)后關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射利多卡因是臨床上常用的鎮(zhèn)痛方法，但Hansen等[1]報道多次關(guān)節(jié)腔內(nèi)利多卡因注射可引起軟骨不良反應(yīng)。我們在研究中發(fā)現(xiàn)，利多卡因的毒性作用具有明顯的時間及濃度依賴性[2]。正常成年人膝關(guān)節(jié)滑液約5～20 mL，臨床上2%利多卡因關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射時除局部浸潤外注入關(guān)節(jié)腔的藥物約0.5～1.0 mL，按體重指數(shù)折算，相當于兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射約5 mmoL/L的利多卡因，經(jīng)關(guān)節(jié)液稀釋后，軟骨組織實際暴露濃度約為2～3 mmoL/L。本實驗中我們選用2 mmoL/L利多卡因干預細胞，觀察兔膝關(guān)節(jié)軟骨細胞Ⅱ型膠原和蛋白多糖mRNA表達的變化，探討利多卡因?qū)浌羌毎|(zhì)代謝的影響，以期對利多卡因的臨床應(yīng)用提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實驗動物 正常兩月齡新西蘭大白兔6 只，體重約1.5～2.5 kg，雌雄不限，山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。各組動物在相同條件下自由飲水、攝食。

1.1.2 主要實驗儀器 a)電子天平；b)動物手術(shù)器械；c)低溫高速離心機(Eppendorf)；d)臺式高速冰凍離心機(2-16PK，Sigma，美國)；e)實時熒光定量PCR儀(Mx3005P，Stratagene，Sigma，美國)；f)凝膠圖象分析系統(tǒng)(Bio-RAD)；g)細胞培養(yǎng)板；h)-20℃冰箱；i)-80℃冰箱；j)60℃烘箱；k)200℃烤箱；l)普通光學顯微鏡；m)酶標儀(Thermo Multiskan Ascent microplate spectrophotometer，Thermo electron corporation，USA)。

1.1.3 主要實驗試劑 a)Trizol試劑；b)RT-PCR試劑；c)異丙醇；d)無水乙醇；e)焦碳酸二乙醋；f)瓊脂糖；g)DNA Marker；h)0.2 mL、0.5 mL、1.5 mL Eppendorf管。

1.4 主要試劑配制 a)DEPC處理水配置：去離子水加DEPC使其濃度為0.1%，37℃水浴2 h，15 kPa×20 min高壓滅菌。b)75%的乙醇配置：75 mL無水乙醇加DEPC處理水至100 mL。3)0.1 M PBS的配制：磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O) 0.4 g，磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O) 6 g，氯化鈉(NaCI) 9 g，加蒸餾水至1 000 mL，調(diào)pH值至7.2。d)TBE緩沖液(即Tris-硼酸鹽緩沖液)的配制，濃貯存液(每升)：5×54 g，Tris堿，27.5 g硼酸，20 mL 0.5 mol/L EDTA；使用液：0.5×(把濃貯存液稀釋十倍)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞的分離與培養(yǎng) 將新西蘭大白兔耳緣靜脈注氣處死，無菌條件下切取雙膝全層關(guān)節(jié)軟骨，無菌D-Hanks液沖洗2次。將軟骨切成約1 mm3大小的碎塊。以0.32% Pronase酶37℃消化90 min，無菌D-Hanks液沖洗2次，再加0.025% Ⅱ型膠原酶37℃過夜消化。所有消化液均用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基。消化結(jié)束后，1 200 r/min，離心3 min，棄上清，無菌D-Hanks液清洗2次，100 μm濾膜過濾，收集細胞，臺盼藍拒染法檢測細胞存活率，用細胞計數(shù)板計數(shù)，計算總量。制成含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液10 mL，細胞密度：2×106/mL。6孔板每孔加入120 μL細胞懸液和2 mL DMEM/F-12培養(yǎng)液，24孔培養(yǎng)板每孔加入30 μL細胞懸液和1 mL DMEM/F-12培養(yǎng)液。于37℃、體積分數(shù)為5%的CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，正常培養(yǎng)2 d后首次換液。上述培養(yǎng)于6孔板和24孔板中的細胞分為二組，對照組、2 mmoL/L利多卡因組，2 mmoL/L利多卡因組加入濃度為2 mmoL/L利多卡因的DMEM/F-12培養(yǎng)液，對照組加入正常DMEM/F-12培養(yǎng)液。其后每3天換液一次，分別于利多卡因干預3 d、6 d、9 d取細胞進行下一步實驗。

1.2.2 RT-PCR法檢測軟骨細胞中蛋白多糖、Ⅱ型膠原mRNA含量 Trizol法提取細胞中總RNA，按試劑盒說明進行cDNA合成和PCR擴增，引物序列如下，蛋白多糖：上游5’-GAGGAGATGGAGGGTGAGGTCTTT-3’，下游5’-CTTCGCCTGTGTAGCAGATG-3’；Ⅱ型膠原；上游5’-GCACCCATGGACATTGGAGG-3’，下游5’-AGCCCCGCACGGTCTTGCTT-3’；GAPDH：上游5’-TGGCCGAGGACTTTGATTG-3’，下游5’-TTGGGAGGGTGAGGGACTT-3’。

PCR反應(yīng)條件：95℃預變性30 s；95℃變性5 s；60℃退火30 s，進行40次循環(huán)，隨后進行融解曲線分析，最后根據(jù)2-△△ct法分析結(jié)果。PCR擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定結(jié)果，每組重復3次，以DNA Marker標記確定條帶大小。

2 結(jié) 果

2.1 Real Time-PCR的檢測結(jié)果 根據(jù)Agilent 2100生物分析儀的分析結(jié)果，對所提取RNA完整性進行分析，RIN=9.9>8.0，符合所要求的核酸條件。

2.2 Ⅱ型膠原在軟骨細胞中的表達 反應(yīng)同時以GAPDH作內(nèi)參照，Real time RT-PCR結(jié)果依據(jù)上述方法進行，2-△△ct為各樣品目基因的相對量。2 mmoL/L干預3 d、6 d、9 d的軟骨細胞Ⅱ型膠原的相對表達量與對照組進行比較，Ⅱ型膠原的表達隨干預時間而下降，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。蛋白多糖的表達3 d時抑制，9 d時升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

表1 各組軟骨細胞蛋白多糖、Ⅱ型膠原mRNA相對表達量的比較

3 討 論

人體正常的關(guān)節(jié)軟骨由軟骨細胞和細胞外基質(zhì)組成。軟骨細胞不到關(guān)節(jié)軟骨總體積的10%，但卻承擔著維持基質(zhì)各成分合成與分解平衡的作用。軟骨基質(zhì)的主要成分為水、蛋白多糖和膠原纖維[3]。基質(zhì)中蛋白質(zhì)與多糖以共價或非共價鍵形式相連構(gòu)成蛋白多糖，后者再與水分子結(jié)合形成凝膠，從而使軟骨具有彈性和張力強度，能夠產(chǎn)生高度張力以對抗壓力，對關(guān)節(jié)起著機械性保護作用。軟骨中的膠原纖維由軟骨細胞合成[3-4]。膠原占軟骨干重的60%～80%，主要為Ⅱ型膠原。膠原形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，賦予軟骨一定的形態(tài)和硬度。在軟骨承受壓力時起到分散力量的作用，對保持關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)方面起重要作用。

利多卡因常作為麻醉藥應(yīng)用于關(guān)節(jié)鏡手術(shù)和關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，并取得良好鎮(zhèn)痛效果[5]。利多卡因是重要的電壓門控性Na+通道阻滯劑[6]，實驗中我們發(fā)現(xiàn)利多卡因誘發(fā)軟骨細胞凋亡具有明顯的時間依賴性和濃度依賴性[2]。我們用2 mmoL/L利多卡因干預細胞。希望在mRNA水平考證利多卡因在接近臨床濃度下對軟骨細胞的影響。

此次實驗按照Togo[7]設(shè)計的引物和實驗條件進行操作，利用RT-PCR技術(shù)對mRNA水平的蛋白多糖和Ⅱ型膠原進行檢測，結(jié)果較為精確可信。

結(jié)果顯示2 mmoL/L利多卡因干預軟骨細胞3 d、6 d、9 d后，Ⅱ型膠原表達量較正常對照組無統(tǒng)計學差異；蛋白多糖表達量較正常對照組先下降，后升高，存在顯著統(tǒng)計學差異。我們認為，由于利多卡因的分子結(jié)構(gòu)具有親水及疏水兩部分[8]。親水部分便于利多卡因進入細胞膜，對細胞的功能產(chǎn)生抑制；表現(xiàn)為早期Ⅱ型膠原及蛋白多糖表達量較正常對照組的降低。而利多卡因的疏水結(jié)構(gòu)使得利多卡因快速地進入細胞外間隙的毛細血管，利多卡因的擴血管作用使這一作用更為加強[8]。因此，短暫地抑制作用后，由于局部血液循環(huán)快速轉(zhuǎn)運利多卡因，降低了利多卡因的濃度，緩解了它對周圍組織的毒性作用。同時由于低濃度的利多卡因具有促進細胞增殖的作用[9]，正常情況下，約95%的軟骨細胞存在于G0/G1期，在利多卡因的作用下，這些細胞從G0進入G1期，或從G1期進入S期，從而提高了增殖能力[9]，造成了第9天蛋白多糖合成與分泌的增加。

Ⅱ型膠原的新陳代謝相對于蛋白多糖而言非常緩慢，性能穩(wěn)定[10]，因此在相對較短的時間內(nèi)其分泌能力未表現(xiàn)出明顯變化。

由于我們觀察的時間僅限于9 d，更長時間干預后軟骨細胞合成基質(zhì)的功能是否有變化，還需進一步觀察考證。

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A Preliminary Study on the Effect of Lidocaine on Anabolism of Collagen Ⅱand Aggrecan in Cultured Chondrocytes

Yang Zhaohui

(Department of Ophthalmology，the Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China)

Objective To investigate the effect of lidocaine on anabolism of cultured rabbit knee articular chondrocytes.Methods Six anesthetized New Zealand big white rabbits were killed.We collected knee cartilage and separated articular chondrocytes，which were exposed to 2 mmoL/L lidocaine or saline for 3﹑6 or 9 days.The relative expression of Collagen Ⅱ and aggrecan of articular chondrocytes were assessed with RT-RNA.SPSS 13.0 software was used to analyze the data.Results RT-PCR assay showed the relative expression of Collagen Ⅱ mRNA exposed to 2 mmoL/L lidocaine for 3﹑6 or 9 days was (18.51±2.34)﹑(16.95±3.10)﹑(15.79±3.57)，the ones exposed to saline for 3﹑6 or 9 days was (19.48±4.01)(18.76±1.96)(17.81±3.05)respevtively，there wasn’t statistically significant difference between lidocaine groups and saline groups (t=-0.32﹑-0.45﹑-0.72)(AllP>0.05).The relative expression of aggrecan mRNA exposed to 2mmoL/L lidocaine for 3﹑6 or 9 days was(9.72±0.32)﹑(9.59±0.78)﹑(12.54±1.06)，the ones exposed to saline for 3﹑6 or 9 days was (10.68±1.07)﹑(10.06±0.93)﹑(9.87±1.12)respevtively，there was statistically significant difference between lidocaine and saline groups at the ninth day (t=2.59，P<0.05).Conclusion The effect was limited on anabolism of cultured rabbit knee articular chondrocytes exposed to lidocaine at finite time and concentration.

lidocaine；chondrocyte；collagen type Ⅱ；aggrecan

1008-5572(2016)12-1094-03

R318.01

A

2016-06-28

楊朝暉(1968- )，男，副主任醫(yī)師，山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院骨科，030001。