草酸鈣型腎結石小鼠模型的研究

曾春暉 李先梅，2 蔡妮娜，3 譚娥玉，4 覃文慧 韋乃球 秦樹森，5 馬雯芳 楊 柯

(1 廣西中醫藥大學藥學院，南寧，530001； 2 廣西欽州市衛生學校，欽州，535000； 3 南寧市中醫醫院，南寧，530001； 4 江門市五邑中醫院，江門，529000； 5 桂林市婦女兒童醫院，桂林，541001)

?

草酸鈣型腎結石小鼠模型的研究

曾春暉1李先梅1，2蔡妮娜1，3譚娥玉1，4覃文慧1韋乃球1秦樹森1，5馬雯芳1楊 柯1

(1 廣西中醫藥大學藥學院，南寧，530001； 2 廣西欽州市衛生學校，欽州，535000； 3 南寧市中醫醫院，南寧，530001； 4 江門市五邑中醫院，江門，529000； 5 桂林市婦女兒童醫院，桂林，541001)

目的：摸索簡單易行的方法誘導草酸鈣型腎結石小鼠模型，為后續藥效學研究提供可靠的動物模型。方法：將健康小鼠分為正常組(A組)、模型組(B組)、模型組(C組)，B組灌胃給予誘石劑(含0.75%乙二醇和0.75%氯化銨的水溶液)，C組灌胃給予誘石劑(含1%乙二醇和1%氯化銨的水溶液)，1 mL/次，3次/d，連續28 d進行造模，A組平行灌胃給予等量生理鹽水。實驗期間觀察小鼠的進食進水情況，生命體征，行為活動及體毛變化，于造模后7、14、21、28 d收集24 h尿液進行草酸和鈣含量的測定，于末次造模后處死小鼠，剖取腎臟進行病理學觀察。結果：于造模第3天開始，B、C組小鼠均出現后肢無力爬行，食欲減退，體毛呈進行性晦暗無光澤，C組小鼠的表現比B組小鼠嚴重；造模7 d后，模型組開始出現不同數量的動物死亡，且C組死亡率高于B組；B組和C組小鼠尿液中草酸、鈣濃度均明顯高于A組(P<0.01)，B組尿草酸濃度明顯高于C組(P<0.05～0.01)，而尿鈣濃度明顯低于C組(P<0.01)；病理學結果表明，A組小鼠腎小管未見擴張和草酸鈣晶體沉積，B組、C組小鼠腎組織均出現腫脹，腎小管管腔明顯擴張、變性、壞死，腎間質有明顯慢性炎性細胞浸潤，表面點狀分布白色結晶或鈣化，在近曲小管和遠曲小管有大片結晶存在，且B組的成石率比模型C組高。結論：采用0.75%乙二醇及0.75%的氯化銨混合溶液作為誘石液，可成功誘導死亡率低、成石率高的草酸鈣型腎結石小鼠模型。

草酸鈣型腎結石；小鼠；動物模型

尿路結石是在泌尿系統中形成足夠大的固體結晶，以至造成阻塞、感染等癥狀的病理礦化過程，是泌尿外科最常見的疾病之一，在泌尿外科住院患者中居首位[1]。其中以草酸鈣型結石為主的上尿路結石(即腎和輸尿管結石)約占95%，已取代膀胱結石成為了尿石癥的主要類型[2]。尿石癥實驗動物模型不但可以深入了解尿結石的形成過程和機制及尿石成因的代謝問題，而且還可以幫助篩選抗結石的中西藥物。因此，設計和建立與人類尿石癥相類似的動物模型，對于探討尿結石的發病機制，預防和延緩結石形成，尋找防治尿結石癥的藥物等方面均有重要的意義。目前，大多以大鼠為研究對象進行模型研究[3-6]，而小鼠模型相對研究資料報道較少。因此，我們以小鼠為載體，以不同濃度的乙二醇和氯化銨為誘石劑進行研究，現報道如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 雄性KM小鼠，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：scxk桂2009-0002。

1.2 實驗試劑 溴百里草酚藍(國藥集團化學試劑有限公司，F20100525)；甲基紅(國藥集團化學試劑有限公司，F20071107)；鉻酸鉀(國藥集團化學試劑有限公司，F20071107)；氧氯化鋯(國藥集團化學試劑有限公司，F20080604)；鉻黑T(天津市登科化學試劑有限公司，20101015)；鈣羧酸(天津市登科化學試劑有限公司，20101125)。

1.3 實驗儀器 TU-1901/1900型紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；EL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；HM355S切片機(德國)；BX60OLYMPUS顯微鏡(日本)。

2 方法

2.1 草酸鈣型腎結石模型的建立 取18～22 g健康KM小鼠，適應性飼養3 d后，隨機分成3組，即正常對照組(簡稱A組)10只，模型組15只(簡稱B組)、模型組15只(簡稱C組)。B組灌胃給予誘石劑(含0.75%乙二醇和0.75%氯化銨的水溶液)，C組灌胃給予誘石劑(含1%乙二醇和1%氯化銨的水溶液)，1 mL/次，3次/d，連續28 d進行造模，A組平行灌胃給予等量生理鹽水。實驗期間各組小鼠自由攝食飲水。重復實驗1次。

2.2 小鼠情況觀察 每日觀察并記錄大鼠的進食進水情況，生命體征，行為活動及體毛變化。

2.3 取材 于造模后第7、14、21、28天將小鼠置代謝籠中接24 h尿液，對尿液中的草酸、鈣進行測定。末次收集尿液后處死小鼠，剖取腎臟。

2.4 指標測定

2.4.1 尿草酸測定 采用鉻酸鉀催化甲基紅光度法[17]測定。按計算公式計算尿中草酸濃度，C草酸(μmol/mL)=(空白管-樣品管)/(空白管-標準管)×0.05。

2.4.2 尿鈣測定 采用EDTA絡合滴定法[18]進行測定。按計算公式計算尿中鈣濃度，C鈣(μmol/mL)=V樣×0.001/1000/0.5×106。

2.4.3 HE染色常規病理 制片，HE染色，鏡下觀察腎小管中草酸鈣結晶分布和腎小管擴張的情況。

3 結果

重復實驗1次，兩次結果基本一致。

3.1 小鼠一般情況 于造模第3天開始，造模組均出現小鼠后肢無力爬行，食欲減退，體毛呈進行性晦暗無光澤，C組小鼠的表現比B組小鼠嚴重，可能與體內鈣的流失，導致骨鈣含量降低有關。造模7 d后，模型組開始出現不同數量的動物死亡。結果見圖1。

圖1 不同誘石劑對小鼠存活情況的影響

3.2 對尿草酸和尿鈣含量的影響 結果表明，與同期A組比較，B組和C組小鼠尿液中草酸、鈣濃度均顯著升高(P<0.01)。同時間B、C 2組相比較，B組生成的尿草酸濃度明顯比C組高(P<0.05～0.01)，而尿鈣濃度明顯比C組低(P<0.01)。結果見表1、表2。

表1 不同誘石劑對小鼠尿液中草酸含量的影響

注:與A組比較，**P<0.01，*P<0.05；與B組比較，##P<0.01，#P<0.05，下同。

表2 不同誘石劑對小鼠尿液中鈣含量的影響

3.3 對腎臟結石及組織損傷的觀察 草酸鈣結晶在常規HE病理切片為無色透明晶體，結果表明，A組小鼠腎小管未見擴張和草酸鈣晶體沉積，B組、C組小鼠腎組織腫脹，表面點狀分布白色結晶或鈣化，鏡下觀察見腎小管管腔明顯擴張，上皮細胞明顯腫脹、變性、壞死、管腔擴張，腎間質有明顯慢性炎性細胞浸潤。有大片結晶存在，結晶主要位于近曲小管和遠曲小管，且B組的成石率比模型C組高。結果見圖2。

圖2 不同誘石劑對腎臟結石及組織的損傷的影響

4 討論

目前動物模型的建立模式是在誘石劑[6]如乙二醇加氯化銨或乙二醇加1α(OH)維生素D3的作用下，誘導生成含草酸鈣結石。乙二醇在體內代謝為草酸，從腎臟分泌排泄。1α(OH)維生素D3可促進腎小管上皮細胞對鈣的吸收，長期應用1α(OH)維生素D3可使尿鈣濃度升高，尿鈣與草酸結合成為草酸鈣，在腎組織內形成晶體，晶體逐漸生長、聚集形成結石。氯化銨可以酸化尿液，長期服用可造成腎小管功能障礙，許多研究表明腎小管損害利于晶體滯留和生長[7]。因此本研究采用乙二醇及氯化銨的混合溶液作為誘石劑。2個濃度下的混合溶液均能促進尿草酸、尿鈣的升高，病切結果顯示腎臟有晶體沉積。但1.0%乙二醇及1.0%的氯化銨混合溶液作為誘石液時，小鼠出現無力爬行，死亡率較高，且晶體量少，這有可能是與氯化銨濃度高，對腎小管損傷大，導致鈣離子流失過多有關，且該誘石劑在造模過程中動物死亡率較高，成石率較低，故認為0.75%乙二醇及0.75%的氯化銨混合溶液更合適作為誘石液誘導草酸鈣型腎結石小鼠模型。

[1]吳階平.泌尿外科學[M].濟南:山東科學技術出版社,2005.

[2]Breslau N，Brinkely L，Hill K，et al.Relationship of animal protein-rich diet to kidney stone formation and calcium metabolism[J].J Clin Endocrinol Metab，1988，66(1)：140-146.

[3]巴元明,曹秋實.兩種草酸鈣結石大鼠模型的比較研究[J].上海交通大學學報：醫學版,2014,34(11):1595-1598.

[4]黃幼霞.乙二醇和氯化銨灌胃建立大鼠腎草酸鈣結石模型的探討[J].海峽藥學,2014,26(1):48-49.

[5]甘澍,王樹聲,向松濤,等.改良大鼠腎草酸鈣結石模型與傳統模型的比較[J].中國中醫急癥,2010,19(6):1004-1006.

[6]曹正國,劉繼紅,段永芳,等.幾種實驗性大鼠腎草酸鈣結石模型的比較研究[J].華中科技大學學報：醫學版,2002,31(5):556-559+563.

[7]Kumar S,SigmonD,Miller T et al.A new model of nephrolithiasis involving tubular dysfunction/injury[J].J Urol,1991,146:1384.

(2016-10-17收稿 責任編輯：洪志強)

Study of Calcium Oxalate Crystallization Model in Mice

Zeng Chunhui1, Li Xianmei1,2, Cai Nina1,3, Tan Eyu1,4, Qin Wenhui1, Wei Naiqiu1, Qin Shusen1,5, Ma Wenfang1, Yang Ke1

(1GuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530001,China;2QinzhouProvincialHealthSchool,Qinzhou535000,China;3NanningHospitalofTraditionalChineseMedicine,Nanning530001,China;4WuyiHospitalofTraditionalChineseMedicine,Jiangmen529000,China;5GuilinWomen′sandChildren′sHospital,Guilin541001,China)

Objective:To explore a method of establishing mice model with calcium-oxalate kidney stones so as to provide the reliable animal models for follow-up study on pharmacodynamics. Methods: Mice were divided to normal group (A group), model group (B group) and model group (C group) randomly. 0.75% ethylene glycol and 0.75% ammonia chloride mixture were administrated orally1 mL/time and 3 times/day to B group mice for 28 consecutive days. 1% ethylene glycol and 1% ammonia chloride mixture were administrated orally to C group mice as well as B group. The same volume of normal saline was administered in parallel to A group. Food and water intake, vital signs, behavior and change of hair were observed in experiment. 24 h urine of mouse was collected for detecting concentration of oxalic acid and calcium at 7, 14, 21, 28 days after modeling. All of mice were sacrificed at the last time, and took the kidney to carry out pathological observation. Results: The phenomenon of inability to crawl on the hind legs, loss of appetite and the dull hair were observed in B and C group mice after modeling 3 days. The situation of C group was more serious than B group. The model animals began to die after modeling 7 days and the mortality rate of C group was higher than that of group B. The concentration of oxalic acid and calcium in urine of B group or C group were more than A group (P<0.01). The concentration of oxalic acid in B group was significantly higher than that in C group(P<0.05～0.01), but the calcium concentration was significantly lower than that of the C group(P<0.01). No abnormalities and Calcium oxalate crystal were found in the kidney of A group mice. In B and C groups, the renal tissues of mice were swollen. The renal tubular lumen showed obvious expansion, degeneration necrosis and there was obvious chronic inflammatory cell infiltration in renal interstitial. The surface of the kidney is dotted with white crystals or calcification. There are large tracts of crystal in the proximal and distal tubules and Number of crystals in B group was more than that in C group. Conclusion: It was found that 0.75% ethylene glycol and 0.75% ammonia chloride mixture can be successfully induced low mortality, high stone rate of calcium oxalate kidney stones in mice.

Calcium oxalate crystallization kidney stone; Mouse; Animal Model

國家自然科學基金項目(編號：81260667)；廣西科技廳面上項目(編號：2011GXNSFA018204)；廣西衛生廳中醫藥科技專項課題(編號：GZKZ10-050)；廣西重點實驗室建設項目(編號：15-140-31、14-045-12、13-051-06)；廣西農作物廢棄物功能成分研究協同創新中心建設(編號：CICAR2015-Z1)

曾春暉(1974—)，女，漢族，教授，博士，碩士研究生導師，主要從事中草藥炮制藥理研究，Tel：(0771)2279423，E-mail：chhzeng@163.com

楊柯(1975—)，男,侗族，教授，理學碩士，碩士研究生導師，從事中草藥藥理學研究，Tel：(0771)2279423，E-mail：kyang_11@126.com

R36

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.11.002