補中柴前連梅煎對支氣管擴張癥大鼠模型肺氣管組織病理學的影響

樊長征 張文江 任培忠 周 偉 苗 青 張 瓊 樊茂蓉

(1 中國中醫科學院西苑醫院，北京，100091； 2 北京中醫藥大學，北京，100029)

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補中柴前連梅煎對支氣管擴張癥大鼠模型肺氣管組織病理學的影響

樊長征1張文江1任培忠2周 偉2苗 青1張 瓊1樊茂蓉1

(1 中國中醫科學院西苑醫院，北京，100091； 2 北京中醫藥大學，北京，100029)

目的：探討補中柴前連梅煎對支氣管擴張癥模型大鼠氣管肺組織病理學的影響。方法：以銅綠假單胞菌液注入大鼠氣管內的方法建立大鼠支氣管擴張癥模型，以補中柴前連梅煎進行干預，比較補中柴前連梅煎對支氣管擴張癥模型大鼠氣管支氣管組織、肺臟組織病理學的影響。結果：在氣管支氣管組織病理評分上，模型組、治療組與空白組在柱狀纖毛上皮、腺體細胞病理評分比較差異無統計學意義(P>0.05)，模型組、治療組與空白組在管腔內分泌物、炎性細胞浸潤病理評分比較差異有統計學意義(P<0.05)，在總分上模型組與空白組比較差異有統計學意義(P<0.05)，而治療組與空白組比較差異無統計學意義(P>0.05)；在肺臟組織病理評分上，模型組與空白組在細支氣管支氣管周圍浸潤部位、浸潤的定性、血管周圍浸潤、間質性肺炎病理評分及總分比較差異有統計學意義(P<0.05)，而模型組與空白組在細支氣管支氣管腔滲出比較差異無統計學意義(P<0.05)；治療組與空白組在氣管支氣管周圍浸潤部位、浸潤的定性、管腔滲、血管周圍浸潤、間質性肺炎病理評分及總分比較均差異無統計學意義(P>0.05)。結論：補中柴前連梅煎可明顯改善支氣管擴張癥模型大鼠氣管支氣管周圍炎性浸潤、血管周圍炎性浸潤及間質性肺炎，其對氣管支氣管組織病理學改善主要表現為整體調理作用。

補中柴前連梅煎；支氣管擴張癥模型；組織病理學

支氣管擴張是由多種原因使支氣管細支氣管產生永久性不能逆轉的病理性擴張，病程長，化膿性感染易反復出現，為慢性氣道炎性反應。由于病情反復發作，尤其是支氣管廣泛性擴張，支氣管擴張患者肺組織、肺功能嚴重被損害，生活質量受到嚴重的影響，個人負擔沉重，社會經濟壓力巨大。其影響因素包括喘息癥狀、痰量、FEV1下降以及是否存在銅綠假單胞菌感染[1]。支氣管擴張患者氣道一旦感染銅綠假單胞菌后，清除不及時，很快產生耐藥并定植，其感染幾乎不能被清除，形成惡性循環，病情反復加重且不易被治愈[2]。銅綠假單胞菌群體感應系統在調節細菌群體的許多生理功能，如顫搐運動、質粒轉移、游動能力、各種毒力因子產生等表達中起重要作用[3]。宋秀杰[4]等認為支氣管擴張PA定植患者癥狀反復加重，肺功能惡化更明顯。因此，銅綠假單胞菌感染與支氣管擴張進展關系密切，是促進支氣管擴張發展的主要因素之一。

我們研究團隊開展了支氣管擴張癥相關的臨床研究與實驗研究，取得了一定的研究成果，認為支氣管擴張癥穩定期的主要病機特點為肺脾氣虛，痰熱蘊肺，在臨床實踐中形成了具有中醫特色的經驗方補中柴前連梅煎。我們運用以銅綠假單胞菌氣管內注入法建立大鼠支氣管擴張癥模[5]，用補中柴前連梅煎進行干預，研究了補中柴前連梅煎對支氣管擴張癥模型大鼠氣管肺組織病理學的影響，取得較好效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 健康成年雄性SD大鼠，體重240～260 g，購于斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司，許可證號：SCXX(京)2011-0004。

1.1.2 菌株 銅綠假單胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)，購于中國藥物檢驗所。

1.1.3 主要儀器 普通光學顯微鏡(日本OLYMPUS BX41)；病理切片機(德國，LEICA RM2235)；圖像分析軟件(LOGENE-I醫用圖像處理系統)。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制作 以銅綠假單胞菌液注入大鼠氣管內的方法建立大鼠支氣管擴張癥模型20只，設空白組大鼠10只，共30只。記錄模型的成功率、穩定性及均衡性。動物均在無菌環境中飼養。

采用腹腔注射戊巴必妥鈉方法麻醉大鼠，麻醉后放置在清潔的手術臺上，仰臥位固定，在唇下3 cm處進行常規消毒，用鑷子固定準備切開處的皮膚，用手術鉗縱向切開皮膚1 cm，頜下肌群暴露后，縱向分離出大鼠氣管，用鑷子固定氣管。然后將1 mL注射器穿刺到氣管中，快速注入0.02 mL銅綠假單胞菌菌液和l mL氣體，快速拔出注射器，托起大鼠，保持大鼠處在垂直體位，防止出現嗆咳窒息，然后縫合頸部皮膚，約5 min后大鼠蘇醒，放置回動物房飼養。手術當天及術后2 d，腔注射青霉素1次，連續3 d，防傷口感染。14 d后評價模型是否成功。

1.2.2 分組設計 設空白對照組(不造模，給予等體積生理水灌服，例數=10)；模型組對照組(造模后，給予等體積生理水灌服，例數=10)；中藥組(造模后，給予2倍劑量中藥灌服，例數=10)；對造模過程中由于操作失誤而致死亡者給予補充。

1.2.3 給藥方案 補中柴前連梅煎組成：黨參20 g、炙黃芪30 g、柴胡10 g、前胡10 g、烏梅10 g、黃連6 g、魚腥草30 g、黃芩15 g、法半夏10 g、茯苓15 g、桔梗12 g、炙甘草10 g。給藥量根據人與大鼠體表面積換算方法計算，按人體每日用藥量的2倍劑量給藥。由中國中醫科學院西苑醫院顆粒藥房制成配方顆粒。成人每日生藥量(平均體重50 kg)3.56 g/kg，大鼠每日生藥量(平均體重250 g)21.36 g/kg，1倍劑量=5.34 g。模型成立后，第二天開始灌胃給藥，飼料正常。連續用藥14 d。

1.2.4 組織病理學檢測 組織病理學檢測：最后一次用藥后24 h后，進行大鼠腹腔注射戊巴必妥鈉麻醉后仰臥位固定。按照文獻順序[6]取氣管支氣管及肺組織放入4%甲醛固定。常規取左肺葉用多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片、HE染色，光鏡下觀察組織學改變，顯微鏡10×物鏡取圖，每片取3個視野成像，每個視野不重復，參考相關文獻[7-9]，對氣管支氣管、肺組織進行病理學指數評分，測得3個數值，取其平均值作為評分。指數評分標準見表1、表2。

表1 氣管支氣管組織病理評分標準

注:氣管組織病理評分總分計算=3A+B+D+C。

表2 肺臟組織病理評分標準

注:肺組織病理評分總分計算=A+3(B+C)+D+E。

2 結果

2.1 各組大鼠組織學特征 空白組：在10倍光鏡下見氣管支氣管組織層次清晰，黏膜上皮細胞及纖毛排列整齊，腔內未見滲出物，纖毛上偶見極少量黏附物，偶見纖毛有少量脫落，管腔內外未見炎性細胞浸潤灶，腔內偶見分泌物，滲出物中偶有夾帶少量脫落上皮；肺泡組織清晰，肺泡壁無增厚，未見異常浸潤或增生。氣管支氣管伴行血管無充血、出血，血管周圍出現炎性浸潤。見圖1。模型組：在10倍光鏡下見支氣管管壁有不同程度破壞、斷裂，局部支氣管壁可見柱狀纖毛上皮細胞增生，偶見芽狀改變，部分壞死、脫落形成潰瘍，管腔與同級支氣管比較顯著擴張，腔內充滿膿細胞及脫落上皮細胞。大量炎性細胞浸潤黏膜下層、平滑肌層、支氣管周圍肺組織，黏膜下層明顯萎縮。部分肺泡組織模糊，肺泡壁無增厚，局部可見異常炎性細胞浸潤或濾泡增生。部分氣管支氣管伴行血管出現充血、出血，局部血管周圍出現炎性浸潤。見圖2。

治療組：在10倍光鏡下見支氣管管壁有不同程度破壞、斷裂，局部支氣管壁可見柱狀纖毛上皮細胞增生，偶見部分壞死、脫落形成潰瘍，管腔與同級支氣管比較擴張，腔內偶可見膿細胞及脫落上皮細胞。局部黏膜下層、平滑肌層、支氣管周圍肺組織可見少量炎性細胞浸潤，部分黏膜下層受擴張管腔壓迫而萎縮。肺泡組織較清晰，肺泡壁無增厚，偶見異常炎性細胞浸潤或濾泡增生。偶可發現氣管支氣管伴行血管出現充血、出血，未發現血管周圍炎性浸潤。見圖3。

2.2 氣管支氣管組織病理評分 統計分析發現，在氣管支氣管組織病理評分上，模型組、治療組與空白組在柱狀纖毛上皮、腺體細胞病理評分比較差異沒有統計學意義(P>0.05)，模型組、治療組與空白組在管腔內分泌物、炎性細胞浸潤病理評分比較差異有統計學意義(P<0.05)，在總分上模型組與空白組比較差異有統計學意義(P<0.05)，而治療組與空白組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

圖1 空白組(HE染色10×)大鼠組織學特征

圖2 模型組(HE染色10×)大鼠組織學特征

圖3 治療組(HE染色10×)大鼠組織學特征

表3 氣管支氣管組織病理評分(分

注：*與空白組比較，P<0.05；#與空白組比較，P>0.05。

2.3 肺臟組織病理評分 統計分析發現，在肺臟組織病理評分上，模型組與空白組在細支氣管支氣管周圍浸潤部位、浸潤的定性、血管周圍浸潤、間質性肺炎病理評分及總分比較差異有統計學意義(P<0.05)，而模型組與空白組在細支氣管支氣管腔滲出比較差異無統計學意義(P>0.05)；治療組與空白組在細支氣管支氣管周圍浸潤部位、浸潤的定性、管腔滲、血管周圍浸潤、間質性肺炎病理評分及總分比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 肺臟組織病理評分(分例數=10)

注：*與空白組比較，P<0.05；#與空白組比較，P>0.05。

3 討論

近年來西苑醫院肺病科研究團隊開展了支氣管擴張癥相關的臨床研究與實驗研究，取得了一定的研究成果[10]，認為支氣管擴張穩定期的主要病機特點為肺脾氣虛，痰熱蘊肺[11]。2015肺病科研究生課題“補脾清肺湯治療支氣管擴張癥(脾虛肺熱證)的臨床觀察”發現實驗組總有效率為93.3%，認為補脾清肺法可以明顯改善患者癥狀，具有較好的療效。為進一步探索支氣管擴張穩定期并銅綠假單胞菌定植患者的中醫治療療效，發現柴前連梅煎治療咳嗽日久，咳吐青綠痰病證，療效非常明顯。

柴前連梅煎組成及服法：柴胡、前胡、烏梅、胡黃連各三錢，豬膽一枚，豬脊髓一條，韭根白五分，童便一盞。同煎至七分，去滓，溫服，不拘時候。其方解是：柴胡解不表不里之風，胡黃連清入肌附骨之熱，前胡去肺脾表里之邪。褚澄氏曰：酸能入骨，則烏梅之用亦可以收斂骨蒸。豬膽所以養陰，豬髓所以養骨，童便所以濟火。韭白辛熱，少用以使向導，經曰:甚者從之，此之謂也(《醫方考》)。前胡實為本方要藥，李士材云:前胡，肺肝藥也，散風驅熱，消痰下氣，開胃化食，止嘔定喘。柴胡、前胡，均為風藥，但柴胡主升，前胡主降，為不同耳。種種功力，皆是搜風下氣之效，肝膽風痰為患者，舍此莫能療。

曹仁伯《繼志堂醫案》常用此方治療勞風：“咳嗽吐出青黃之痰，項強惡風音爍，寒熱分爭，是名勞風。”在《繼志堂醫案》中記載有用柴前梅連煎治療勞風的典型病案：“咳嗽吐出青黃之痰、項強、惡風、音爍、寒熱分爭，是名勞風。服秦艽鱉甲散而更甚者，當進一層治之。”曹氏自注此方之歌訣曰：“咳嗽由來十八般，只因邪氣入于肝。”每以咳吐黃綠青痰為據，診其脈，弦數獨見于左關為憑，即可用柴前連梅煎。

程門雪《金匱篇解》對本方有精辟之評語:“柴前梅連散為勞風咳嗽、痰色青綠惟一之治法。癥見合符，靈效如響。凡斯妙法，實為中醫不傳之秘，惜乎知所用者少耳。”“勞風治法以開達伏邪、酸苦泄熱為主，而不急急養陰生津者，伏風痰熱未凈故也。此方配合極佳，莫可言喻。以柴、前之一升一降，梅、連之一收一泄，反佐韭白辛以開結，童便秋石咸以導引，韭白、秋石之一開一引，面面俱到矣。更佐豬膽之苦寒降泄膽熱，合童便之咸寒引火下潛，使以豬脊髓之入骨搜邪并養精髓。組方層層相制，制其短而用其長，誠非淺學所能幾及也。”

研究團隊根據支氣管擴張癥穩定期肺脾氣虛、痰熱蘊肺病機特點，在柴前連梅煎治療青綠痰病證基礎上，加以補肺健脾治療，取得了一定的療效，取方名為補中柴前連梅煎。補中柴前連梅煎組成主要有黨參、炙黃芪、柴胡、前胡、烏梅、黃連、魚腥草等。主要治療癥見咳嗽，咯吐膿性痰，痰色青綠，氣短、體倦乏力、食少納呆、自汗、面色黃，舌紅或淡紅，苔薄或膩，脈弦或滑。補中柴前連梅煎的方解為以黨參、黃芪為君藥，補肺建脾益氣，柴胡、前胡、烏梅、黃連、黃芩、魚腥草為臣藥，柴胡、前胡為風藥，柴胡主升，前胡主降，一升一降，搜風下氣，祛肝膽風痰，烏梅、黃連一收一泄，黃芩清肺瀉熱，魚腥草清熱解毒，共起酸苦泄熱，清肺化痰，佐以法半夏、茯苓、桔梗和胃健脾，豁痰降氣，宣肺止咳。甘草調和諸藥，同時助黨參黃芪補肺脾而益元氣。此方兼顧了支氣管擴張癥緩解期正虛與邪實共存的病機特點，能提高患者機體免疫力，同時可減緩緩解期支氣管擴張癥患者的氣道慢性炎性的進展。現代藥理研究發現黨參醇提物抗菌、抗炎[12]、祛痰、平喘[13]。黃芪多種提取物均有抗病毒性微生物[14]、抗病原微生物作用[15]。因此君藥黨參、黃芪補具有傳統的肺建脾益氣作用外，也具有抗菌、抗病毒、祛痰、平喘等現代藥理作用。

根據各組大鼠組織學特征結果分析發現治療組與模型組比較支氣管擴張程度有減輕，黏膜下層、平滑肌層、支氣管周圍肺組織炎性細胞浸潤明顯減輕，組織結構有較好恢復，氣管支氣管伴行血管充血、出血程度明顯減少，未發現血管周圍炎性浸潤。肺泡組織機構與空白組基本一致。說明補中柴前連梅煎可減緩支氣管擴張癥模型大鼠支氣管擴張的發展，可減少氣管支氣管周圍及肺泡炎性細胞浸潤。根據氣管支氣管組織病理評分結果分析發現補中柴前連梅煎在改善支氣管擴張模型大鼠的柱狀纖毛上皮、腺體細胞、管腔內分泌物、炎性細胞浸潤個單項病理評分方面沒有表現出明顯的差異，而在病理評分總分方面表現出與空白組無統計學意義。說明補中柴前連梅煎的治療支氣管擴張癥模型大鼠的作用為整體作用。從病理方面證明中醫藥治療支氣管擴張癥的作用為整體調理作用。根據肺臟組織病理評分結果分析發現補中柴前連梅煎可明顯改善支氣管擴張癥模型大鼠細支氣管支氣管周圍炎性浸潤、血管周圍炎性浸潤及間質性肺炎，這可能與補中柴前連梅煎中柴胡、前胡搜風下氣，祛肝膽風痰，烏梅、黃連收泄，黃芩清肺瀉熱，魚腥草清熱解毒有關。

綜上所述，通過補中柴前連梅煎干預支氣管擴張癥模型大鼠的反應性效應及組織病理學變化，從整體及器管組織層面探討了補中柴前連梅煎治療支氣管擴張癥中銅綠假單胞菌感染的作用機制。認為補中柴前連梅煎可明顯改善支氣管擴張癥模型大鼠細支氣管支氣管周圍炎性浸潤、血管周圍炎性浸潤及間質性肺炎，其對氣管支氣管組織病理學改善主要表現為整體調理作用。下一步需從分子生物學方面進一步研究補中柴前連梅煎對支氣管擴張癥中銅綠假單胞菌群體感應系統的影響機制。

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(2016-02-29收稿 責任編輯：張文婷)

Effect of Buzhong Chaiqian Lianmei Decoction on Histopathology of the Lung and Trachea of Rat Model with Bronchiectasis

Fan Changzheng1, Zhang Wenjiang1, Ren Peizhong2, Zhou Wei2, Miao Qing1, Zhang Qiong1, Fan Maorong1

(1XiyuanHospitalofCACMS,Beijing100091,China; 2BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective: To explore the effect of Buzhong Chaiqian Lianmei Decoctionon on histopathology of the lung and trachea of rat model with bronchiectasis. Methods: The study was to compare the different effects of Buzhong Chaiqian Lianmei Decoctionon on histopathology of tracheobronchial tissue and lung tissue in rat model with bronchiectasis which was established by intratracheal injection of pseudomonas aeruginosa liquid. Results: The scores in the ciliated columnar epithelium and glandular cell pathological of model group, treatment group and control group were not significantly different (P>0.05). The scores in intraluminal secretions and inflammatory cell infiltration of model group, treatment group and control group were significantly different (P<0.05).The total tracheobronchial pathological score of tracheobronchial pathological in model group compared with the control group had significant difference (P<0.05), while no significant difference showed between the treatment group and the control group (P>0.05). The scores in the bronchus invasion site, infiltration of qualitative, perivascular infiltration, interstitial pneumonia pathological and the total lung pathological score between the model group and the control group were significantly different (P<0.05) and there was no significantly different in the scores of the bronchioles bronchial exudate between the model group and the control group (P>0.05). The scores in the tracheal and bronchial infiltrative sites, infiltration of qualitative and vascular permeability, perivascular infiltration, interstitial pneumonia pathological and the total lung tissue pathological score between the treatment group and the control group showed not significantly different (P>0.05). Conclusion: Buzhong Chaiqian Lianmei Decoction can significantly improve bronchiectasis in rats with peripheral inflammatory infiltration, perivascular inflammatory infiltration and interstitial pneumonia, and improve the tracheobronchial tissue pathology via holistic regulation.

Buzhong Chaiqian Lianmei Decoction; Rat model with bronchiectasis; Histopathology of lung and trachea

中國中醫科學院西苑醫院第三批苗圃項目[編號：YKY-MP(2013)—9]

樊長征(1979.09—)，男，博士，主治醫師，研究方向：中醫藥防治肺系疾病的臨床與實驗研究，E-mail:faanchzh@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.11.044