藏紅花對糖尿病大鼠視網膜神經節細胞凋亡過程中線粒體途徑的影響

黨曉潔

(西安市第四醫院眼科,西安,710004)

?

藏紅花對糖尿病大鼠視網膜神經節細胞凋亡過程中線粒體途徑的影響

黨曉潔

(西安市第四醫院眼科,西安,710004)

目的:觀察藏紅花對糖尿病大鼠視網膜神經節細胞凋亡過程中線粒體功能的影響。方法:采用隨機數字表法將72只8～10周齡健康無眼疾SD雄性大鼠隨機分為正常對照組、糖尿病模型組、藏紅花治療組,每組24只。正常對照組大鼠不作任何處理。其余組采用鏈脲佐菌素(SYZ)25 mg/(kg·d)連續腹腔注射3 d,1次/d,建立2型糖尿病模型,以血糖≥16.7 mmol/L為造模成功。模型成功建立后,藏紅花治療組50 mg/kg的劑量腹腔注射藏紅花素溶液,1次/d,連續3個月。并檢測3組大鼠視網膜醛糖還原酶(AR)、神經細胞凋亡及視網膜中B細胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)、bcl-2相關X蛋白(bcx)、細胞色素C(cyt-c)、半胱天冬酶-3(cespase-3)蛋白的表達。結果:糖尿病模型組大鼠視網膜中的AR活性明顯高于正常對照組和藏紅花治療組,且差異有統計學意義(P<0.05);對照組RGCs層見少量TUNEL染色陽性細胞,成棕褐色染色;B:糖尿病模型組RGCs、內核層可見大量TUNEL染色陽性細胞;C:藏紅花治療組RGCs、內核層可見量TUNEL染色陽性細胞,但數量遠少于糖尿病模型組;糖尿病模型組大鼠視網膜中的bcl-2、bax、cyt-c及caspase-3蛋白表達均明顯低于正常對照組和藏紅花治療組,且差異有統計學意義(P<0.05)。結論:藏紅花可通過抑制AR活性、上調凋亡抑制基因bcl-2的表達及下調凋亡促進基因bax、cyt-c和caspase-3的表達,抑制線粒體凋亡途徑活化,減少糖尿病大鼠視網膜神經細胞的凋亡,發揮對糖尿病視網膜損傷的保護作用。

藏紅花;糖尿病;視網膜神經節;細胞凋亡;線粒體;功能

糖尿病視網膜病變(Diabetic Retinopathy,DR)發病機制既往認為主要與多元醇、蛋白激酶C、糖基化終末產物、氨基己糖等途徑有關[1]。但單獨應用針對這4條途徑的特異性阻斷劑不能取得滿意的治療效果,這4條途徑似乎彼此獨立[2-3]。Cheung N[4]提出活性氧(Reactive Oxygen,ROS)的過量產生與上述4條途徑關系密切。ROS主要生成于線粒體電子傳遞過程,可導致線粒體內DNA的氧化損傷,影響線粒體呼吸功能、降低線粒體膜電位,導致細胞功能障礙。視網膜缺血再灌注損傷(RIR)可引起視神經損傷,與細胞凋亡、炎性反應及氧自由基密切相關[5]。藏紅花是鳶尾科植物,主要成分藏紅花素,通過抑制視網膜炎性反應因子IL-lB、TNF-α的含量,起到抗炎作用[6]。我們觀察藏紅花素對RIR時大鼠視網膜組織結構及線粒體途徑的影響,以探討藏紅花素對糖尿病大鼠視神經損傷作用及其機制?，F將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 建立糖尿病大鼠模型、分組及視網膜取材 雄性SD大鼠72只,體重200～250 g,無特定病原體級,醫藥大學實驗動物中心提供。采用隨機數字表法將72只8～10周齡健康無眼疾SD雄性大鼠隨機分為正常對照組、糖尿病模型組、藏紅花治療組,每組24只。正常對照組大鼠不作任何處理。其余組采用鏈脲佐菌素(SYZ)25 mg/(kg·d)連續腹腔注射3 d,1次/d,建立2型糖尿病模型,以血糖≥16.7 mmol/L為造模成功。模型成功建立后,藏紅花治療組50 mg/kg的劑量腹腔注射藏紅花素溶液,1次/d,連續3個月。大鼠水合氯醛麻醉后,取得視網膜血管組織。

1.2 紫外分光光度測定視網膜AR活性 取液氮中保存的視網膜,按體積比1∶4加入預冷的(0.01 mmol/L PBS,pH 7.2～7.4)制成組織勻漿,4 ℃、3 000 r/min離心15 min,離心半徑13.5 cm,上清即為酶粗提取液,用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白的表達進行定量分析。AR活性測定反應體系的組分(最終濃度)為:0.1 mol/L PBS[內含0.4 mol/L(NH4)2SO4,pH 6.2],0.08 mmol/L NADPH,5 mmol/L DL-甘油醛,5 L酶粗提取液,反應體積100 L。其中DL-甘油醛為反應底物。反應自加入底物開始,37 ℃水浴反應5 min,加入預冷的PBS終止反應,采用DU800型紫外分光光度計(美國Beckman Coulter公司)測定NADPH在340 nm處的吸光度(A340)值。AR活性單位定義為每毫克蛋白質每分鐘消耗1 mol NADPH,以1 mol/(min·L)表示。

1.3 培養細胞的免疫組織化學法鑒定 RPE細胞在無菌條件下進行分離,EDTA質量分數為0.02%和胰蛋白酶質量分數為0.25%進行消化,培養瓶內接種入細胞密度為5×104個/mL,體積分數5% CO:孵箱內溫度37 ℃進行培養。RPE細胞的活力采用錐蟲藍染色法測定,首先預冷丙酮固定細胞爬片10 min。細胞鑒定采用角蛋白單克隆抗體,用1∶3 000稀釋的鼠抗人角蛋白抗體為一抗,羊抗小鼠lgG采用生物素標記作為二抗,滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液,DAB顯色,充分沖洗脫水,封片,拍照。

1.4 Western blot法檢測視網膜中bcl-2、bax、cyt-c及caspase-3的蛋白表達 視網膜組織細胞總蛋白進行RIPA裂解提取,并行蛋白定量檢測,變性,上樣,電泳,轉至聚偏氟乙烯膜,質量分數5%脫脂奶粉封閉,加入相應抗體(l%脫脂奶粉稀釋作為一抗和二抗,1∶300為一抗效價比,1∶1 000為二抗效價比),曝光洗片,膠片掃描后用Ipwin32圖像分析軟件分析結果,450 nm細胞吸光度作為測定波長,內參基因為β-actin,目的基因A值/β-actin A值作為各凋亡調控因子的相對表達量,每個檢測指標樣本量為3。分別計算bcl-2、bax、cyt-c及caspsse-3條帶與B-actin條帶的灰度比值,以代表目的的蛋白的相對表達水平。

2 結果

2.1 視網膜組織中AR的活性 糖尿病模型組大鼠視網膜中的AR活性明顯高于正常對照組和藏紅花治療組,且差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠視網膜AR活性和細胞AI的比較

注:與糖尿病模型組比較,*P<0.001;AR:醛糖還原酶,AI凋亡指數。

表2 3組大鼠視網膜中bcl-2、bax、cyt-c及caspase-3蛋白表達

注:與糖尿病模型組比較,*P<0.001。

2.2 視網膜組織的TUNEL染色 結果見圖1。

圖1 TUNEL法檢測到3組大鼠RGCs凋亡情況(×400)

注：A:對照組RGCs層見少量TUNEL染色陽性細胞,成棕褐色染色;B:糖尿病模型組RGCs、內核層可見大量TUNEL染色陽性細胞;C:藏紅花治療組RGCs、內核層可見量TUNEL染色陽性細胞,但數量遠少于糖尿病模型組;注:RGCs:視網膜神經節細胞。

2.3 3組大鼠視網膜中bcl-2、bax、cyt-c及caspase-3蛋白表達 糖尿病模型組大鼠視網膜中的bcl-2、bax、cyt-c及caspase-3蛋白表達均明顯低于正常對照組和藏紅花治療組,且差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

3 討論

DR早期病變主要是視網膜血管病變。目前研究已證實糖尿病血管病變與細胞凋亡和黏附分子表達、炎性損傷有密切關系[7]。盡管發病機制尚十分清楚。糖尿病視網膜疾病的療法將會深刻影響遺傳性視網膜疾病患者的生活質量[8]。正因如此,這個領域吸引了大量的研究去開發相應的療法[9-11]。有幾個因素使得眼睛成為基因替換療法的理想器官,包括易接近性、免疫豁免、體積小、組織分區和天然的對側對照。筆者觀察藏紅花對糖尿病大鼠視網膜神經節細胞凋亡過程中線粒體功能的影響。相關研究認為視網膜主要損傷在視網膜色素上皮細胞、Muller細胞及視網膜全層的線粒體[12-15]。線粒體疾病是指病變發生在細胞的線粒體內,是線粒體基因組(mtDNA)和/或核基因組(nDNA)編碼線粒體蛋白的基因變異引起的線粒體結構和氧化磷酸化功能的損傷,而引起的疾病。線粒體病通常表現為ATP能量減少、活性氧自由基(ROS)增多和乳酸中毒等造成細胞損傷或細胞凋亡等[16-17]。人的部分生理結構屬于自然凋亡,如人的有尾階段,尾部在發育過程中自動凋亡。細胞凋亡在人神經變性病中起重要作用[18-22]。在營養因子匱乏的情況下,促凋亡分子Bax是交感神經元和運動神經元死亡所必需的。而且,成年Bax缺失性轉基因小鼠比其野生型副本具有更多的神經元。這些發現表明,在許多神經元集群中,Bax在發育過程中調控自然發生的細胞死亡。也觀察到,在胚胎期(Embryonic Life),Bax是外周和CNS神經元自然發生死亡的關鍵調節劑(Davies,2000)。在一定的實驗條件下,已知的抗凋亡蛋白Bel-2和Bcl-xL可中和Bax的活性。設想當促凋亡蛋白的濃度超過抗凋亡蛋白的濃度時,會刺激凋亡。此類凋亡包括線粒體中的變化,其最終導致稱為半胱天冬酶(Caspases)的絲氨酸蛋白酶家族的激活[23-25]。這導致死亡細胞從內部被消化,這是一種細胞凋亡標志對調節細胞凋亡的基因和蛋白特別是負調控(即抑制)細胞凋亡的那些蛋白的更多了解,可以設計出新的治療法,從而可防止細胞凋亡的不適當激活[26-27]。藏紅花素是從藏紅花中提取的單體,通過腹腔注射及口服后可以吸收入血液,到達視網膜;靜脈注射藏紅花提取液可以減少腦缺血再灌注模型的腦損傷,說明藏紅花提取液可以通過血腦屏障[28]。研究結果顯示糖尿病模型組大鼠視網膜中的AR活性明顯高于正常對照組和藏紅花治療組,且差異有統計學意義(P<0.05);對照組RGCs層見少量TUNEL染色陽性細胞,成棕褐色染色;B:糖尿病模型組RGCs、內核層可見大量TUNEL染色陽性細胞;C:藏紅花治療組RGCs、內核層可見量TUNEL染色陽性細胞,但數量遠少于糖尿病模型組;糖尿病模型組大鼠視網膜中的bcl-2、bax、cyt-c及caspase-3蛋白表達均明顯低于正常對照組和藏紅花治療組,且差異有統計學意義(P<0.05)。提示藏紅花可通過抑制AR活性、上調凋亡抑制基因bcl-2的表達及下調凋亡促進基因bax、cyt-c和caspase-3的表達,抑制線粒體凋亡途徑活化,減少糖尿病大鼠視網膜神經細胞的凋亡,發揮對糖尿病視網膜損傷的保護作用。但由于視網膜損傷本身是個多因素協同的結果,有關其具體機制還有待進一步拓展體內外實驗研究,觀察相關信號通路、視神經血流改變及相關基因表達情況加以探討。

[1]Madsen-Bouterse SA,Mohammad G,Kanwar M,et al.Role of mitochondrial DNA damage in the development of diabetic retinopathy,and the metabolic memory phenomenon associated with its progression[J].Antioxid Redox Signal,2010,13(6):797-805.

[2]Kusari J,Zhou S,Padillo E,et al.Effect of memantine on neuroretinal function and retinal vascular changes of streptozotocin-induced diabetic rats[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2007,48(11):5152-5159.

[3]Bidani AK,Picken M,Hacioglu R,et al.Spontaneously reduced blood pressure load in the rat streptozotocin-induced diabetes model: potential pathogenetic relevance[J].Am J Physiol Renal Physiol,2007,292(2):F647-654.

[4]Cheung N,Wong TY.Diabetic retinopathy and systemic vascular complications[J].Prog Retin Eye Res,2008,27(2):161-176.

[5]Ruchko M,Gorodnya O,LeDoux SP,et al.Mitochondrial DNA damage triggers mitochondrial dysfunction and apoptosis in oxidant-challenged lung endothelial cells[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2005,288(3):L530-535.

[6]Wright E Jr,Scism-Bacon JL,Glass LC.Oxidative stress in type 2 diabetes:the role of fasting and postprandial glycaemia[J].Int J Ctin Pract,2006,60(3):308-314.

[7]Miyahara S,Kiryu J,Yamashiro K,et al.Simvastatin inhibits leukocyte accumulation and vascular permeability in the retinas of rats with streptozotocin-induced diabetes[J].Am J Pathol,2004,164(5):1697-1706.

[8]McDonnell MA,Abedin MJ,Melendez M,et al.Phosphorylation of murine caspase-9 by the protein kinase casein kinase 2 regulates its cleavage by caspase-8[J].J Biol Chem,2008,283(29):20149-20158.

[9]Perche O,Doly M,Ranchon-Cole I.Caspase-dependent apoptosis in light-induced retinal degeneration[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2007,48(6):2753-2759.

[10]Zeidan YH,Wu BX,Jenkins RW,et al.A novel role for protein kinase Cdelta-mediated phosphorylation of acid sphingomyelinase in UV light-induced mitochondrial injury[J].FASEB J,2008,22(1):183-193.

[11]Zhang Z,Qin X,Zhao X,et al.Valproic acid regulates antioxidant enzymes and prevents ischemia/reperfusion injury in the rat retina[J].Curr Eye Res,2012,37(5):429-437.

[12]Shi Y,Wu X,Gong Y,et al.Protective effects of caffeic acid phenethyl ester on retinal ischemia/reperfusion injury in rats[J].Curr Eye Res,2010,35(10):930-937.

[13]Berger S,Savitz SI,Nijhawan S,et al.Deleterious role of TNF-alpha in retinal ischemia-reperfusion injury[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2008,49(8):3605-3610.

[14]Yang R,Tan X,Thomas AM,et al.Crocetin inhibits mRNA expression for tumor necrosis factor-alpha,interleukin-1beta,and inducible nitric oxide synthase in hemorrhagic shock[J].JPEN J Parenter Enteral Nutr,2006,30(4):297-301.

[15]Maccarone R,Di MS,Bisti S.Saffron supplement maintains morphology and function after exposure to damaging light in mammalian retina[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2008,49(3):1254-1261.

[16]Ochiai T,Shimeno H,Mishima K,et al.Protective effects of carotenoids from saffron on neuronal injury in vitro and in vivo[J].Biochim Biophys Acta,2007,1770(4):578-584.

[17]Wang Q,Tang XN,Yenari MA.The inflammatory response in stroke[J].J Neuroimmunol,2007,184(1-2):53-68.

[18]龐東渤,洪晶.視網膜色素上皮細胞凋亡途徑的研究[J].眼科新進展,2007,27(6):405-407.

[19]蔡善君,嚴密,毛詠秋,等.藍光致人視網膜色素上皮細胞凋亡與線粒體膜電位和細胞色素C的關系[J].中華眼科雜志,2006,42(12):1095-1102.

[20]周瓊,李恩輝,劉永琰,等.不同激光強度經瞳孔溫熱療法對色素兔視網膜細胞凋亡的影響[J].中華眼底病雜志,2006,22(4):249-252.

[21]陳麗娟,曹西友,苗林.兔眼經瞳孔溫熱療法閾值能量治療的組織病理反應和細胞凋亡[J].國際眼科雜志,2007,7(4):993-996.

[22]張躍紅,牛膺筠,王紅云,等.低氧預適應對小鼠視網膜光感受器細胞光損傷的防護作用[J].中華眼科雜志,2005,41(7):631-635.

[23]Dentchev T,Yao Y,Pratico D,et al.Isoprostane F2alpha-VI,a new marker of oxidative stress,increases following light damage to the mouse retina[J].Mol Vis,2007,13:190-195.

[24]Lansel N,Hafezi F,Marti A,et al.The mouse ERG before and after light damage is independent of p53[J].Doc Ophthalmol,1998,96(4):311-320.

[25]Krishnanoorthy RR,Crawford MJ,Chaturvedi MM,et al.Photo-oxidative stress down-modulates the activity of muclear factor-kappa B Via involvement of caspase-1,leading to apoptosis of photoreceptor cells[J].J Biol Chem,1999,274(6):3734-3743.

[26]Ballinger SW,Van Houten B,Jin GF,et al.Hydrogen peroxide causes significant mitochondrial DNA damage in human RPE cells[J].Exp Eye Res,1999,68(6):765-772.

[27]Hansson MJ,Mattiasson G,M?nsson R,et al.The nonimmunosuppressive cyclosporin analogs NIM811 and UNIL025 display nanomolar potencies on permeability transition in brain-derived mitochondria[J].J Bioenerg Biomembr,2004,36(4):407-413.

[28]Qi Y,Chen L,Zhang L,et al.Crocin prevents retinal ischaemia/reperfusion injury-induced apoptosis in retinal ganglion cells through the PI3K/AKT signalling pathway[J].Exp Eye Res,2013,107:44-51.

(2015-11-05收稿 責任編輯：王明)

Effect of Saffron on Mitochondria Pathway during Apoptosis of Retinal Ganglion Cells in Diabetic Rats

Dang Xiaojie

(Xi′anNo.4Hospital,Xi′an710004,China)

Objective:To observe the effect of saffron on mitochondrial function of diabetic rat retinal ganglion cell apoptosis process.Methods:Using random number table method,72 SD male rats 8 ～ 10 weeks old with healthy eyes were randomly assigned to normal control group, diabetic model group, and saffron treatment group (n=24). Normally controlled rats experienced no treatment. Other rats were given streptozocin (SYZ) 25 mg / (kg / D) by intraperitoneal injection for 3 days,once daily, to establish the model of type 2 diabetes and their blood sugar would be more than or equal to 16.7 mmlo/L for a successful modeling. After the model was established, saffron treatment group was provided with intraperitoneal injection of crocin solution 50 mg / kg, once per day, for 3 consecutive months. And Retinal aldose reductase (AR), neural cell apoptosis and B cell lymphoma / leukemia-2 (Bcl-2), cell pigment and Bcl-2 associated X protein (BCX), cytochrome C (Cyt-C), cespase-3 protein expression were detected.Results:The AR activity in the retina of diabetic rats was significantly higher than that of the normal control group and the treatment group, and the difference was statistically significant (P<0.05); there was small amount of TUNEL positive cells in RCGs layers of the control group, brown staining; B: The RGCs and nuclear layer in diabetic model group had a number of TUNEL staining positive cells; C: there were TUNEL staining positive cells in RGCs and kernel layer in Saffron treatment group, but much less than the number of that of the diabetic model group; Retinal Bcl-2, Bax, Cyt-C and caspase-3 protein expression of diabetic rats were much lower than those of normal control group and treatment group, and the difference is statistically significant (P<0.05).Conclusion:Saffron inhibited AR activity and the activation of the mitochondrial apoptotic pathway, regulated expression of apoptosis inhibition of bcl-2 gene and apoptosis promoting gene Bax, Cyt-C and Caspase-3, reduced the apoptosis of nerve cells in the retina of diabetic rats and showed protective effect on diabetes optic omental injury.

Saffron; Diabetes mellitus; Retinal ganglion cells; Apoptosis; Mitochondrial; Function

國家自然科學基金項目(編號:81273902)——藏紅花對改善線粒體功能抑制視網膜神經節細胞凋亡的機制研究

黨曉潔(1980.09—),女,大學本科,主治醫師,研究方向:小兒眼科,斜弱視,E-mail:36934386@qq.com

R587.1;R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.11.048