竹筍殼自然發酵物中乳酸菌的分離與鑒定

李巧亮， 張 萍， 牛 春

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司質量與技術中心，寧夏銀川 750101)

竹筍殼自然發酵物中乳酸菌的分離與鑒定

李巧亮， 張 萍， 牛 春*

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司質量與技術中心，寧夏銀川 750101)

[目的]獲得促進竹筍殼乳酸發酵的微生物。[方法]以竹筍殼自然發酵物為菌種來源，用MRS-S培養基，通過連續定向繼代培養，篩選出pH下降迅速、乳酸含量高的菌種,并對復合菌株和4株單菌的部分發酵性能進行了研究。[結果]通過16S rDNA克隆文庫分析獲得了4個克隆，分別為植物乳桿菌亞種(Lactobacillusplantarumsubsp)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、乳酸桿菌(Lactobacillussp.)、戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)。復合菌種培養24 h后，pH下降至3.16，乳酸含量達11.41 mg/mL。[結論]該復合菌株能在溫度10～45 ℃和pH 3～9的環境中較好地生長，適于不同地區和環境的竹筍殼青貯時廣泛應用。

竹筍殼；乳酸菌；分離；鑒定；發酵性能

竹筍殼是竹筍長成竹子后脫落下來或竹筍經加工后的副產品，產量巨大，若得不到合理利用，會造成很大的資源浪費和環境污染。竹筍殼成分豐富，含水溶物7.73%、果膠0.82%、半纖維素28.12%、木質素20.34%、纖維素41.66%[1]，還含有糖、總氮、氨基酸等營養物質[2]。

秸稈類物質大多被加工成飼料供反芻動物食用。但是，由于秸稈木質纖維素含量高，所以嗜口性差，不易消化。研究表明，微生物發酵是改善秸稈嗜口性和提高飼用價值的重要途徑。

賈燕芳等[3]研究表明，若飼料發酵過程中乳酸菌發酵占優勢，飼料品質就好。這表明乳酸能改善秸稈發酵品質，利用乳酸發酵可獲得較理想的秸稈青貯飼料。近年來研究表明，通過限制性培養定向馴化自然微生物群體，可獲得微生物組成穩定、功能強大、對外界環境穩定的微生物群體[4]。筆者用竹筍殼自然發酵物為菌種來源，通過長期定向限制性培養篩選出pH下降迅速、乳酸產量高、對環境變化耐性強的乳酸菌復合系，并對其組成多樣性和代謝性質進行了研究。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 元竹竹筍殼，由寧國茂盛源食品有限公司提供。將竹筍殼粉碎至1～2 cm,加水70%，填裝于100 mL螺口瓶，封口后30 ℃下恒溫自然發酵。發酵9 d后，選擇pH小于4.0并發出酸香味的發酵物作為菌種篩選來源。

1.2 培養基 MRS培養基[5]:用于乳酸菌的分離活化及計數。MRS-S培養基：MRS培養基中葡萄糖改為蔗糖。溶鈣圈培養基：MRS培養基中加入2%CaCO3。溴甲酚紫培養基：MRS培養基中加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液。

1.3 竹筍殼自然發酵物中乳酸菌的分離、篩選及鑒定

1.3.1 乳酸菌的分離與篩選。將MRS培養液和MRS-S培養液裝至50 mL螺口瓶，裝液量90%，加入5.5 g鮮重的發酵物，30 ℃下靜止培養。

72 h后，以5%接種量連續定向繼代培養，保留pH下降迅速、產乳酸量較多、對外界環境變化比較穩定的培養物，直到最終獲得穩定的培養物。

取發酵液梯度稀釋后涂至MRS平板并在培養箱中30 ℃靜止培養48 h，挑取溴甲酚紫平板變黃和有溶鈣圈的單菌落在平板上劃線分離反復純化，將革蘭氏染色[6]陽性菌株保存。

再將這些菌株按5% 的接種量接種到竹筍殼中30 ℃發酵，篩選出pH下降速度快、產乳酸量多的菌株保存。

1.3.2 乳酸定性測定。氣相色譜-質譜聯用法：將待測乳酸菌株在MRS-S液體培養基內30 ℃下培養72 h離心取上清液稀釋適當倍數，用0.25 μm的微孔濾膜過濾后進行GC-MS，以標準乳酸液作為對照進行定性分析。GC-MS條件如下：50 ℃ 2 min后以5 ℃/min的速度升至100 ℃，再以15 ℃/min的速度升至190 ℃，保持2 min，共18 min；汽化溫度為190 ℃；檢測器溫度為230 ℃；檢測器電壓為1.5 kV；載氣為氦氣(64 kPa)，流量為30 mL/min；進樣器分流，分流比1∶22。

1.3.3 菌種鑒定[7]。用變性梯度凝膠電泳、平板分離及建立16S rDNA克隆文庫3種手段相結合進行菌種的鑒定。

1.4 菌株性能測定

1.4.1 乳酸定量測定。以乳酸標準品為外標，建立標準曲線，采用外標法定量，測定條件同“1.3.2”。

1.4.2 竹筍殼接種效果。將竹筍殼粉碎成1～2 cm長,加純水至含水量為70%(質量濃度),用MRS-S培養液培養24 h的復合菌株按1.0×106CFU/g(濕重)噴灑,均勻攪拌,裝滿100 mL的螺口瓶密封,30 ℃培養。以加等量無菌培養基的處理為對照,發酵30 d后各取3組樣品進行重復測定。

取發酵料0.5 g，置于4.5 mL無菌水中,振蕩后靜置20 min,取汁液，測定pH。

取發酵料1.0 g，加2.0 mL純化水,充分振蕩靜置后擠汁液過0.25 μm濾膜,測定乳酸,方法同“1.3.2”。

經60 ℃、48 h烘干后粉碎,過40目篩,粗蛋白的測定采用凱氏定氮法,粗纖維的測定用酸堿洗滌法,粗脂肪的測定采用索氏提取法,具體方法參考文獻[8]。

1.4.3 復合菌株24 h生長曲線和pH的變化。使用紫外分光光度計在可見光600 nm 處每隔2 h 測定MRS-S 培養液的OD值，以空白培養基為對照。

1.4.4 菌株對pH和溫度的穩定性。將MRS-S液體培養基調至不同pH，將培養24 h的菌株接種于其中，培養24 h 后于波長600 nm處測定培養液OD值。將不同溫度下培養24 h的菌株于波長600 nm處測定培養液OD值。

2 結果與分析

2.1 菌種分離與篩選 從圖1可以看出，通過連續定向繼代培養，直到復合菌株的pH穩定，發現MRS-S培養的菌株pH變化更穩定，第23代pH達到3.18，以此為樣品來源進行菌株篩選。

圖1 傳代過程中復合菌系pH的變化Fig.1 Changes of pH value of compound bacteria during passage

對樣品進行系列稀釋后在MRS-S培養基平板上進行菌種分離，經革蘭氏染色鏡檢、溴甲酚紫顯色、融鈣圈反應、30 ℃下培養液中發酵產酸比較、接種到竹筍殼中30 ℃下發酵產酸比較，最終篩選出4株產酸較快的菌株1、2、3、4，其菌落形態如表1所示。

表1 篩選菌株的形態學特征

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態學特征。根據菌落形態、革蘭氏反應及菌體形態，從第23代培養物分離到4株單菌,它們具有乳酸菌的特性。

2.2.2 乳酸定性測定結果。通過GC-MS分析4株菌的培養液中均有與乳酸標準液相同的色譜峰，出峰時間為14.899 min，由此初步確定該4株菌為乳酸菌。

2.2.3 16S rDNA序列分析。用16S rDNA克隆文庫的方法對這4株菌進行了序列分析。由表2可知，這4株菌均屬于乳桿菌，且相似度均為99%。

表2 克隆文庫的16S rDNA序列分析

2.3 菌株性能測定

2.3.1 復合菌株及其分離菌的第23代發酵產物。采用GC-MS方法，并用乳酸標品作為外標定量，測定了復合菌株第23代及其4株單菌MRS-S培養液的發酵產物乳酸含量。從圖2可以看出，復合系在培養開始至72 h的培養期間始終檢測到乳酸和乙酸(少量)還有醇類(微量)。乳酸和乙酸多有利于降低pH，微量出現的醇類則有利于增加發酵飼料的風味，可提高飼料的嗜口性。因此，復合菌株的發酵產物均有利于提高發酵飼料品質，增加飼料的嗜口性，沒有發現影響飼料品質的成分。復合菌株的乳酸產量明顯高于單個菌株，具有更好的發酵優勢。

圖2 復合菌株及其分離菌的第23代發酵產物中的乳酸含量Fig.2 Lactic acid content in composite strain and twenty-third generation fermentation products of isolated bacteria

2.3.2 接種復合菌劑和自然發酵產物的化學成分比較。從圖3可以看出，相對于原材料，發酵45d后的發酵料其pH均有降低，且增加了乳酸含量，其中接種發酵料中乳酸含量較未接種的對照有所增加，粗蛋白含量也有所提高，粗纖維含量有所降低。由此可見，接種后大大提高了乳酸含量，增加了飼料的嗜口性，同時使竹筍殼得到一定軟化，改善了飼料的發酵品質。

圖3 接種復合菌劑和自然發酵產物的化學成分比較Fig.3 Comparison of chemical constituents of products with composite agents and natural fermentation

2.3.3 復合菌株24 h生長曲線、pH變化及其對溫度和酸堿的穩定性。從圖4可以看出，復合菌株適應期為前6 h,6 h以后進入對數期，其生長周期較短，培養16 h后即進入穩定期,OD600值達到2.000。

圖4 菌種24 h生長曲線Fig.4 The growth curve of strain within 24 h

從圖5可以看出，復合菌株pH降低較快，培養10 h后pH達到3.82，進入穩定期后pH在3.16左右。

圖5 菌種24 h pH的變化Fig.5 Changes of strain pH within 24 h

從圖6可以看出，復合菌株在pH 4～8、24 h的生長量OD600值均超過1.121，而在pH為3和9時生長較慢,OD600值分別為0.223和0.112。

圖6 pH對菌種OD600值的影響Fig.6 Effects of pH on strain OD600

從圖7可以看出，復合菌株能在溫度10～45 ℃內生長,其中在37 ℃生長最活躍,培養24 h時,其OD600值為1.959，23 ℃和30 ℃培養時仍保持較好的生長，而10 ℃和45 ℃培養時生長緩慢。

圖7 溫度對菌種OD600值的影響Fig.7 Effects of temperature on strain OD600

3 結論

從竹筍殼自然發酵物中分離出來的復合菌株主要組成為戊糖乳桿菌、乳酸桿菌、植物乳桿菌、植物乳桿菌亞種，都屬于乳酸桿菌。

復合菌可在24 h內使MRS-S培養基pH降至3.16,代謝產物中乳酸的生成量很高,達到11.41 mg/mL，高于單一菌株。另外還有少量乙酸和微量醇類物質生成，可改善飼料風味，而且，沒有影響飼料品質的產物生成。

接種復合菌于竹筍殼發酵可以提高乳酸含量，增加飼料嗜口性，同時使竹筍殼得到一定軟化，改善了飼料的發酵品質。比竹筍殼自然發酵效果要好[9-10]。

該復合系能在溫度10～45 ℃和pH 3～9的酸堿環境中較好地生長,表現出對環境的耐性,適于不同地區和環境的竹筍殼青貯時廣泛應用[11-12]。

[1] 周曉潔,李建強,陳延興.竹筍殼化學成分分析[J].武漢科技學院學報,2010(1):1-3.

[2] 周兆祥，田荊祥，賴椿根.竹筍殼的化學成分[J].浙江林學院學報，1991，8(1)：54-59.

[3] 賈燕芳,石偉勇.不同添加劑對筍殼青貯發酵品質的影響[J].浙江農業科學,2011(2):341-343.

[4] HARUTA S,CUI Z J,HUANG Z,et al.Construction of a stable microbial community with high cellulose-degradation ability [J].Appl Microbiol Biotechnol,2002,59(4):529-534.

[5] 楊潔彬,郭興華,張箎,等.乳酸菌:生物學基礎及應用[M].北京:中國輕工業出版社,1996.

[6] 凌代文,東秀珠.乳酸菌細菌分類鑒定及實驗方法[M].北京:中國輕工業出版社, 1999.

[7] 王小芬,高麗娟,楊洪巖,等.苜蓿青貯用乳酸菌復合系Al2的組成多樣性[J].微生物學報, 2006,46(5):767-772.

[8] 朱燕,夏玉宇.飼料品質檢驗[M].北京:化學工業出版社,2003：10-30.

[9] VAN BEEK S，PRIEST F G.Evolution of the lactic acid bacterial community during malt whisky fermentation:Apolyphasic study[J].Appl Environ Microbiol,2002,68(1):297-305.

[10] 崔宗均,李美丹,樸哲,等.一組高效穩定纖維素分解菌復合系MC1的篩選及功能[J].環境科學,2002,23(3):36-39.

[11] DANNER H，HOLZER M，MAYRHUBER E,et al.Acetic acid increases stability of silage under aerobic conditions[J].Appl Environ Microbiol,2003,69(1):562-567.

[12] 馮樹，張忠澤，混合菌.一類值得重視的微生物資源[J].世界科技研究與發展,2001,22(3)：44-47.

Isolation, Identification of Lactic Acid Bacteria from Bamboo Shell Natural Fermentation Products

LI Qiao-liang, ZHANG Ping, NIU Chun*

(Quality and Technology Center of Ningxia Tairui Pharmaceulical Co.Ltd., Yinchuan, Ningxia 750101)

[Objective]To obtain the community that could accelerate the fermentation of the bamboo shell.[Method]A lactic acid bacteria community was constructed from the natural fermented products of the bamboo shell by continuous restricted subcultivation in the MRS-S broth.The strains could lower the pH of the broth quickly, and produce high amount of lactic acid.Some of the fermentation characteristics of these four strains and the community were also studied.[Result]The results of 16S rDNA sequencing showed that the closest species of four clones wereLactobacillusplantarumsubsp,Lactobacillusplantarum,Lactobacillussp.,Lactobacilluspentosus.The pH value of the strains dropped to 3.16 and the amount of lactic acid reached 11.41 mg/mL after 24 h cultivation in the broth.[Conclusion] The compound strain could grow well in 10-45 ℃ and pH 3-9 environment, it is suitable for the wide application of bamboo shell silage in different regions and environments.

Bamboo shell; Lactic acid bacteria; Isolation; Identification; Fermentation performance

李巧亮(1989- )，女，寧夏西吉人，碩士研究生，研究方向：菌種選育。*通訊作者，工程師，從事抗生素菌種選育、改造和發酵研究。

2016-10-26

S 816.3;X 172

A

0517-6611(2016)34-0001-03