COL4A1/A2基因變異與出血性腦血管病及梗死后出血轉化研究進展

索閱，李偉，王擁軍

出血性腦血管病是腦血管病中致殘率、致死率高的類型，血腦屏障破壞參與了腦出血的發病、血腫擴大、顱內壓增高等病理過程。基底膜成分的異常間接提示著血腦屏障的破壞。4型膠原作為基底膜的重要組成部分，是許多出血性腦血管病動物實驗中血腦屏障破壞的觀測指標之一。COL4A1/A2基因的變異可導致穿通腦、COL4A1/A2相關性腦血管病或遺傳性血管病、腎病、動脈瘤和肌肉痙攣綜合征，并且與散發性深部腦出血、反復腦出血存在相關性。研究COL4A1/A2基因變異與腦出血、蛛網膜下腔出血、梗死后出血轉化為代表的散發性出血性腦血管病的相關性，將有助于出血性腦血管病針對性治療和發病后的出血控制。

1 出血性腦血管病及其危害

出血性腦血管病主要包括腦出血、蛛網膜下腔出血及梗死后出血轉化。患病人群預后較差，給社會帶來較大負擔。2013年一項中國卒中類型的流行病學分析研究發現中國人群與白種人人群（6%～20%）相比，總體上腦出血占所有類型腦血管病的比例更高（17%～51%）[1]。全球疾病負擔（Global Burden of Disease，GBD）研究估計2010年全球新發出血性卒中事件的發病率為81.52/100 000（95%CI72.27～92.82）[2]。腦出血的幸存者仍有復發風險，尤其對于潛在病因不明的患者。一項納入多項觀察性研究的系統評價發現復發性腦出血的年風險率為2.0%～2.4%，第一年的復發風險高達1.8%～7.4%[3]。

在世界衛生組織的研究中，中國動脈瘤性蛛網膜下腔出血發病率為2.0/100 000[4]。而且1/4動脈瘤性蛛網膜下腔出血患者死亡，約一半的幸存者遺留一些永久性神經功能缺損。

出血轉化可發生在10%～40%的缺血性卒中患者中，增加卒中的致殘率及致死率。

2 COL4基因變異

單核苷酸多態性變異、可變數串聯重復序列、轉座子的有/無以及結構變異在基因組中分布密度較大，被認為是導致個體間表型差異、各種遺傳性疾病及疾病易感性的重要原因[5]。研究一些已知單基因遺傳的腦血管病對發現散發腦血管病致病機制有一定啟示作用。臨床研究的分子層面上，人群中某一染色體位點或基因的常見、少見或罕見變異與表型的研究有助于發現散發性腦血管病發病機制。多項病例報道及基礎、臨床研究發現COL4基因與出血性腦血管病關系密切。

2.1 基因變異的分類與定義 人類基因組中常見的遺傳變異類型主要有單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）變異和拷貝數變異（copy number variant，CNV）。SNP是指染色體基因組水平上由單個核苷酸變異引起的DNA序列多態性，包括堿基的轉換、顛換、插入或缺失[5]。

SNP由于其二態性、分布廣泛而成為研究個體間表型差異、不同群體和個體對疾病易感性的研究熱點。基于常見疾病/常見變異模型（common disease/common variant，CDCV）和經典疾病異質性假說中間的中立假說，最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＞0.01的SNP可能導致＞90%的個體間基因異質，繼而很大程度上導致表型的異質[6]。常見變異是指MAF介于0.05～0.5之間的基因變異，少見變異是指MAF介于0.01～0.05之間的變異，罕見變異是指MAF＜0.01的變異。

2.2 膠原4基因及產物 4型膠原占基底膜（basement membrane，BM）成分的50%左右[7-8]。在哺乳動物中，膠原4蛋白是由6種不同且相互關聯的膠原4a蛋白基因——COL4A1到COL4A6分別編碼的。其中a1（Ⅳ）蛋白和a2（Ⅳ）蛋白是典型膠原4分子的a蛋白，具有物種間高度保守性。其蛋白產物幾乎出現于所有基底膜組織中[9]。人類的COL4A1和COL4A2基因位于第13號染色體。包括增強子在內的額外調節元件位于COL4A1和COL4A2的第一個內含子區域，在雙向啟動子啟動的轉錄過程中必不可少[10-12]，并有報道COL4A2下游存在靜息子[12]。順式調節元件之間的相互作用調節人類COL4A1和COL4A2基因的轉錄，保證組織特異性和表達產物蛋白分泌的水平與比例[13-14]。COL4A1和COL4A2以5’端相鄰，之間間隔127 bp的片段，為共用的雙向、結構特殊的啟動子區。編碼的前膠原蛋白多肽鏈包含成膠原結構域，以甘氨酸-X-Y的形式重復排列，即每3個氨基酸即有一個甘氨酸出現。A1和A2鏈以A1A1A2的方式構成異源三聚體，并通過鏈間結構域的相互作用最終交聯稱為超分子4型膠原網絡結構。4型膠原對BM的構成、介導BM與細胞間的相互作用、維持其穩定性起到重要作用。

2.3 膠原4基因變異相關單基因遺傳腦血管COL4A1/A2相關的小動脈病是一類可嬰兒期或成年期起病的具有神經系統、全身系統性表現的疾病，與COL4A1突變相關的常染色體顯性遺傳疾病被歸結為四類：常染色體顯性遺傳1型穿通腦，腦小血管病伴腦出血[15-16]，腦小血管病伴Axenfeld-Rieger畸形伴遺傳性血管病腎病，遺傳性血管病、腎病、動脈瘤和肌肉痙攣綜合征（Hereditary angiopathy with nephropathy，aneurysm and cramps，HANAC）。同一染色體位點上COL4A2基因突變可導致相似的包含腦血管病的多系統受累表型：反復顱內出血[17]、早發孔洞腦畸形、先天性偏癱、顱內動脈瘤、腎病、肌病。

2.4 膠原4基因與散發性出血性腦血管病 散發性出血性腦血管病的發病年齡相對較大、致死率高的特點使得家系分析較為困難，密集的基因組水平基因分型工具的發展可以分析同一祖先的非親緣關系人群中的個體基因信息，并可分析不同表型致病基因的遺傳性估計值[18-20]。隨著分子遺傳學進展及在醫學基礎研究中的應用，尤其全基因組關聯分析（genome wide association study，GWAS）技術的應用，使得查找出血性腦血管病致病或相關基因位點成為可能。

3 膠原4基因與腦出血

3.1 人群基因研究 2007年Vahedi等[21]報道了一例COL4A1基因（G805R）突變導致反復深部腦出血；2012年一項COL4A2編碼區及側翼序列測序研究，在入組的96例患者中，4例腦出血患者中發現3個導致物種間高度保守的氨基酸缺失的SNP：COL4A2E1123G，COL4A2Q1150K，COL4A2A1690T，這3個SNP未出現在正常對照組的284例個體中，其中的2個SNP可導致COL4A2蛋白滯留于內質網，從而觸發內質網應激并活化未折疊蛋白質反應[22]。另一項COL4A1編碼區及側翼序列測序研究，在入組的96例腦出血患者中（48例可能的淀粉樣血管變性、48例可能的高血壓性腦出血）有兩例攜帶COL4A1的SNP（rs200786329、rs397514624），在體外細胞功能試驗中證實此2個SNP可分別導致脯氨酸羥化異常、前膠原蛋白a1穩定性下降，繼而使COL4a1分泌量下降，異常a1蛋白胞內聚集。

圍產期新生兒出血性腦血管病可以導致孔洞腦畸形，2013年Murray團隊在一位穿通腦患者基因中發現COL4A2基因第28個外顯子中一堿基的變異，導致成膠原結構域的其中一個甘氨酸轉變為天冬氨酸，并且患者未患病的父親也具有這一變異。通過對患者家系成員的皮膚活檢，證實這一變異可激活未折疊蛋白反應，導致異常折疊的4型膠原在胞內內質網的聚集，促進蛋白酶體對未折疊4型膠原的降解，導致基底膜缺陷。苯基丁酸（phenylbutyric acid，PBA）作為化學分子伴侶可促進蛋白折疊，在患者的成纖維細胞中，使內質網體積減小，降低內質網應激，降低了患者細胞凋亡比例。因此提出分子伴侶可作為出血性腦血管病、孔洞腦畸形的一種干預措施[23]。

一項腦小血管病先證者的家系研究發現，先證者家族中一腦小血管病患者口服抗凝藥后因癥狀性顱內出血去世，此家系患病的6個成員中均發現COL4A1基因的第25個外顯子中G1769A變異，導致轉錄產物由甘氨酸轉換為谷氨酸，導致膠原4a1蛋白結構的不穩定，使基底膜不穩定，故考慮具有COL4A1基因變異者對抗凝治療或具有更高的顱內出血風險[24]。

考慮到一些罕見家族遺傳性單基因病的致病基因可能包含與散發性常見形式腦血管病相關的變異，一項納入15個腦血管病隊列研究的歐洲祖先人群系統評價研究中，包含3個隊列組成1545例腦出血患者（分為深部或腦葉出血），其分析結果也驗證了這一假設，發現膠原4合成基因COL4A1/COL4A2的3個SNP與散發性深部腦出血相關：rs9521732、rs9521733、rs9515199[25]。這3個位于COL4A2內含子區域的常見變異（MAF介于0.05～0.5）與深部腦出血這一表型顯著相關，且相互之間具有高度連鎖不平衡性，數據分析顯示此3個SNP與其他腦血管病表型無顯著相關，與已知的COL4A2外顯子區的腦出血相關SNP（rs117412802、rs62621875、A1690T）之間無緊密連鎖不平衡。

3.2 動物實驗研究 上述提到的2006年一項對腦小血管病家族的測序研究后續進行的動物實驗發現COL4A1+/Δex40小鼠均出現腦出血，其中50%出生當日即死亡，此種成年鼠傾向于出現自發多灶性腦出血，在觀察到的23個腦出血病灶中22個位于基底節區（深部），1個位于腦葉。故考慮COL4A1+/Δex40小鼠具有發生深部腦出血的傾向[26]。

2012年的96例腦出血患者測序研究的后續動物實驗中，對培養的COL4A2+/G646D、COL4A1+/Δex40小鼠胚胎成纖維細胞進行蛋白質印跡，發現COL4a1/COL4a2的分泌量減少，而胞內聚集增多，并且驗證了內質網膠原蛋白滯留先于膠原蛋白的胞外／胞內比例的上升[21]，導致細胞毒性反應，得出COL4A1和COL4A2基因突變共同具有導致散發性腦出血的作用的結論。

2015年一項COL4A1變異小鼠實驗，再次證實細胞內異常膠原蛋白聚集與腦出血有關，并且在腦出血發生的特定時間窗內，給予4-PBA這一外源性分子伴侶促進蛋白折疊，可以有效減小腦出血的嚴重程度，改善預后[26]。并提出具有膠原4基因變異者在體育運動強度、缺血性腦血管事件后抗栓藥物選擇方面，應更謹慎地權衡抗栓與出血風險之間的利弊關系。

4 膠原4基因與蛛網膜下腔出血

一項以雄性遠交蛛網膜下腔出血大鼠為模型的實驗發現，在內膜穿刺手術法制備蛛網膜下腔出血實驗組后，利用蛋白電泳及圖像分析定量，分析蛛網膜下腔出血后不同時間點出血同側皮層COL4、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的分布、含量，發現與假手術對照組相比，實驗組在蛛網膜下腔出血后24～72 h內，隨著基底膜逐漸破壞，血腦屏障通透性增大，造成顱內壓升高和血管神經源性水腫，導致功能預后的下降及死亡等終點事件[27]。

兩項荷蘭人群研究發現4型膠原基因（COL4A1）的變異與顱內動脈瘤相關[28-31]。而在日本人群中，上述研究中COL4A1的相關變異與顱內動脈瘤未見到相關性[31]。

顱內動脈瘤標本病理研究可觀察到基底膜成分的碎片，例如4型膠原和纖連蛋白[32]，有觀點認為可能由硫酸乙酰肝素糖蛋白-2與其他成分失去關聯所致。另一方面，4型膠原碎片的出現也可能由COL4A1變異導致，并且這種變異導致了動脈瘤的破裂[28]。

5 膠原4基因與出血轉化

缺血性腦血管病是因血管病變導致神經元死亡的過程，近年來，缺血性卒中腦損害過程中的血管損害受到關注。腦微循環系統的小血管均包含3層結構：血管內皮細胞、基膜、星形細胞末足。內皮細胞和星形細胞末足連接基底膜。發生缺血性腦血管病時，基膜的破壞、拆解使內皮細胞和星形細胞末足與基底膜失去連接，最終導致小血管通透性增加，出血轉化，腦組織水腫和微循環功能障礙[33]。

在一項納入28項觀察性研究和19項隨機對照試驗的缺血性卒中出血轉化研究中，發現隨著抗血小板及溶栓藥物使用的增加，出血轉化的發生率明顯上升。而在未使用抗血小板藥或溶栓治療的患者中，幾乎不會發生嚴重的出血轉化，發生率僅為8.5%，癥狀性顱內出血發生率僅1.5%[34]。

一系列動物實驗和臨床研究發現，組織型纖溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，tPA）除溶栓作用外，也是神經血管單元的重要信號因子和細胞外蛋白酶。tPA介導腦發育過程中細胞基質的重塑，干預其可塑性，可通過與NMDA型谷氨酸受體相互作用而增大潛在的細胞毒性鈣超載。在特定濃度下，tPA可以定向作用于血管，最終通過增加卒中后MMP的調節異常而破壞細胞外基質的完整性，增加血管源性細胞死亡，血腦屏障滲漏、水腫、出血轉化[35]。

4型膠原作為血腦屏障中基底膜的重要成分，在各項實驗的免疫標記中被作為基底膜破壞程度、血腦屏障滲漏程度的指標。具有COL4基因變異的患者是否對抗血小板、溶栓治療具有更高不穩定性，更傾向于出血轉化；在缺血性腦血管病后一系列局部腦組織病理變化通路中，基底膜完整性是否較無變異者更易于受到藥物、信號因子等繼發因素影響，有待進一步探究。

6 總結

基底膜是血腦屏障的重要組成部分，對細胞起結構支持和動態調節細胞行為與微環境關系的作用。4型膠原是基底膜最為重要的組成部分。COL4A1/A2基因的變異已證實與包括反復腦出血、深部腦出血表型的單基因遺傳綜合征相關。動物實驗證實不同的COL4A1/A2基因變異可導致異常折疊的COL4a1、a2蛋白沉積于胞內，導致基底膜穩定性及調節功能降低，可以導致腦出血、梗死后出血轉化、腦出血血腫擴大和腦水腫等，引起預后不良及死亡率增加。人群基因研究發現在散發性出血性腦血管病患者可存在COL4A1/A2基因變異。不同遺傳背景人群的基因頻率、外顯率存在差異，進一步開展在不同遺傳背景下散發性出血性腦血管病的人群中COL4A1/A2變異篩查，對于理解出血性腦血管病發病機制，早期干預高危人群（例如增加膠原蛋白折疊的外源分子伴侶），尋找新的更具針對性的治療方法有重要意義。同時，缺血性腦血管病人群中服用抗血小板聚集藥物，抗凝藥物等抗栓治療，或是接受溶栓治療患者，均存在潛在出血風險，對于既往不明原因腦出血、顱內動脈瘤、一級親屬中腦出血病史者，進行高危基因，如COL4A1/A2基因變異的篩查，對于指導二級預防和急性期治療可能有一定參考意義。

1 Tsai CF，Thomas B，Sudlow CL. Epidemiology of stroke and its subtypes in Chinese vs white populations：a systematic review[J]. Neurology，2013，81：264-272.

2 Feigin VL，Forouzanfar MH，Krishnamurthi R，et al.Global and regional burden of stroke during 1990-2010：fi ndings from the Global Burden of Disease Study 2010[J]. Lancet，2014，383：245-254.

3 Poon MT，Fonville AF，Al-Shahi Salman R. Longterm prognosis after intracerebral haemorrhage：systematic review and meta-analysis[J]. J Neurol Neurosurg Psychiatry，2014，85：660-667.

4 Connolly ES Jr，Rabinstein AA，Carhuapoma JR，et al. Guidelines for the management of aneurysmal subarachnoid hemorrhage：a guideline for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association[J]. Stroke，2012，43：1711-1737.

5 眭維國，李麗萍，車文體，等. 人類遺傳疾病中常見變異和罕見變異的研究策略[J]. 國家檢驗醫學雜志，2011，32：1847-1850.

6 Wang WY，Barratt BJ，Clayton DG，et al. Genomewide association studies：theoretical and practical concerns[J]. Nat Rev Genet，2005，6：109-118.

7 Boute N，Exposito JY，Boury-Esnault N，et al. TypeⅣ collagen in sponges，the missing link in basement membrane ubiquity[J]. Biol Cell，1996，88：37-44.

8 Fidler AL，Vanacore RM，Chetyrkin SV，et al. A unique covalent bond in basement membrane is a primordial innovation for tissue evolution[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2014，111：331-336.

9 Timpl R. Structure and biological activity of basement membrane proteins[J]. Eur J Biochem，1989，180：487-502.

10 Pollner R，Fischer G，P?schl E，et al. Regulation of divergent transcription of the genes coding for basement membrane type Ⅳ collagen[J]. Ann N Y Acad Sci，1990，580：44-54.

11 Fischer G，Schmidt C，Opitz J，et al. Identi fi cation of a novel sequence element in the common promoter region of human collagen type Ⅳ genes，involved in the regulation of divergent transcription[J]. Biochem J，1993，292：687-695.

12 Haniel A，Welge-Lüssen U，Kühn K，et al.Identi fi cation and characterization of a novel transcriptional silencer in the human collagen typeⅣ gene COL4A2[J]. J Biol Chem，1995，270：11 209-11 215.

13 Pollner R，Schmidt C，Fischer G，et al. Cooperative and competitive interactions of regulatory elements are involved in the control of divergent transcription of human Col4A1 and Col4A2 genes[J]. FEBS Lett，1997，405：31-36.

14 Kuo DS，Labelle-Dumais C，Gould DB. COL4A1 and COL4A2 mutations and disease：insights into pathogenic mechanisms and potential therapeutic targets[J]. Hum Mol Genet，2012，21：R97-R110.

15 Weng YC，Sonni A，Labelle-Dumais C，et al. COL4A1 mutations in patients with sporadic late-onset intracerebral hemorrhage[J]. Ann Neurol，2012，71：470-477.

16 Lemmens R，Maugeri A，Niessen HW，et al. Novel COL4A1 mutations cause cerebral small vessel disease by haploinsuf fi ciency[J]. Hum Mol Genet，2013，22：391-397.

17 Gunda B，Mine M，Kovács T，et al. COL4A2 mutation causing adult onset recurrent intracerebral hemorrhage and leukoencephalopathy[J]. J Neurol，2014，261：500-503.

18 Devan WJ，Falcone GJ，Anderson CD，et al.Heritability estimates identify a substantial genetic contribution to risk and outcome of intracerebral hemorrhage[J]. Stroke，2013，44：1578-1583.

19 Yang J，Benyamin B，McEvoy BP，et al. Common SNPs explain a large proportion of the heritability for human height[J]. Nat Genet，2010，42：565-569.

20 Yang J，Lee SH，Goddard ME，et al. GCTA：a tool for genome-wide complex trait analysis[J]. Am J Hum Genet，2011，88：76-82.

21 Vahedi K，Kubis N，Boukobza M，et al. COL4A1 mutation in a patient with sporadic，recurrent intracerebral hemorrhage[J]. Stroke，2007，38：1461-1464.

22 Jeanne M，Labelle-Dumais C，Jorgensen J，et al.COL4A2 mutations impair COL4A1 and COL4A2 secretion and cause hemorrhagic stroke[J]. Am J Hum Genet，2012，90：91-101.

23 Murray LS，Lu Y，Taggart A. Chemical chaperone treatment reduces intracellular accumulation of mutant collagen Ⅳ and ameliorates the cellular phenotype of a COL4A2 mutation that causes haemorrhagic stroke[J].Hum Mol Genet，2014，23：283-292.

24 Gould DB，Phalan FC，van Mil SE，et al. Role of COL4A1 in small-vessel disease and hemorrhagic stroke[J]. N Engl J Med，2006，354：1489-1496.

25 Rannikm?e K，Davies G，Thomson PA，et al.Common variation in COL4A1/COL4A2 is associated with sporadic cerebral small vessel disease[J].Neurology，2015，84：918-926.

26 Jeanne M，Jorgensen J，Gould DB. Molecular and genetic analysis of collagen type Ⅳ mutant mouse models of spontaneous intracerebral hemorrhage identify mechanisms for stroke prevention[J].Circulation，2015，131：1555-1565.

27 Sch?ller K，Trinkl A，Klopotowski M，et al.Characterization of microvascular basal lamina damage and blood-brain barrier dysfunction following subarachnoid hemorrhage in rats[J]. Brain Res，2007，1142：237-246.

28 Ruigrok YM，Rinkel GJ，van’t Slot R，et al. Evidence in favor of the contribution of genes involved in the maintenance of the extracellular matrix of the arterial wall to the development of intracranial aneurysms[J].Hum Mol Genet，2006，15：3361-3368.

29 Ruigrok YM，Rinkel GJ，Wijmenga C. The versican gene and the risk of intracranial aneurysms[J]. Stroke，2006，37：2372-2374.

30 R?dahl E，Knappskog PM，Majewski J，et al.Variants of anterior segment dysgenesis and cerebral involvement in a large family with a novel COL4A1 mutation[J]. Am J Ophthalmol，2013，155：946-953.

31 Mohan D，Munteanu V，Coman T，et al. Genetic factors involves in intracranial aneurysms —actualities[J]. J Med Life，2015，8：336-341.

32 Skirgaudas M，Awad IA，Kim J，et al. Expression of angiogenesis factors and selected vascular wall matrix proteins in intracranial saccular aneurysms[J].Neurosurgery，1996，39：537-545; discussion 545-547.

33 Wang CX，Shuaib A. Critical role of microvasculature basal lamina in ischemic brain injury[J]. Prog Neurobiol，2007，83：140-148.

34 Lindley RI，Wardlaw JM，Sandercock PA，et al. Frequency and risk factors for spontaneous hemorrhagic transformation of cerebral infarction[J]. J Stroke Cerebrovasc Dis，2004，13：235-246.

35 Wang X，Tsuji K，Lee SR，et al. Mechanisms of hemorrhagic transformation after tissue plasminogen activator reperfusion therapy for ischemic stroke[J].Stroke，2004，35：2726-2730.