力學刺激對軟骨下骨修復過程中OPG/RANKL/RANK通路及破骨細胞的影響

朱鴻飛，褚立希，譚朝丹

骨關節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是生物學和力學因素共同作用下細胞外基質、軟骨細胞、軟骨下骨三者合成與分解失衡的結果，是一種以關節(jié)邊緣和軟骨下骨質再生以及關節(jié)軟骨變性和丟失為特征的慢性骨性關節(jié)疾病。近年來，機械力學刺激在軟骨下骨損傷修復以及重塑過程中的作用正日益受到關注。成骨細胞與破骨細胞的動態(tài)平衡是軟骨下骨重塑與修復的關鍵，力學刺激對于成骨細胞的影響已有許多相關研究，而破骨細胞在骨修復過程中活性明顯強于成骨細胞，近年來越來越多的學者對此已有關注，本文就力學刺激對軟骨下骨修復過程中破骨細胞相關分子方面的作用機制予以綜述。

1 破骨細胞與軟骨下骨

軟骨下骨承接著關節(jié)軟骨向下傳導的應力負荷，主要起到吸收應力、將應力負荷向關節(jié)的周圍和下方傳遞，可以保護關節(jié)軟骨以緩沖震蕩，維持關節(jié)形狀。目前，軟骨下骨在未來的骨關節(jié)炎治療中將發(fā)揮重要作用已得到眾多學者的公認[1]。骨關節(jié)炎時，正常的力學傳導平衡被打破，軟骨下骨骨組織所承受的應力負荷明顯增加，當超過骨小梁對于應力的緩沖能力的限度時，骨小梁會發(fā)生微骨折，持續(xù)的微骨折的積累導致關節(jié)軟骨下骨及骨組織的損傷。為了修復損傷的骨組織，在異常應力和生物學作用下，骨皮質的纖維血管組織浸潤鈣化軟骨，得以侵炎性組織入，繼而活化破骨細胞，導致軟骨內的骨化中心激活以及潮線擴張，加速軟骨的退變。研究發(fā)現，OA軟骨下骨中組織蛋白酶K、基質金屬蛋白酶-9 (Matrix Metalloproteinase-9，MMP-9)、細胞核因子kB受體活化因子配體(Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand, RANKL)和抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-Resistant Acid Phosphatase，TRAP)等骨吸收標記的基因表達水平增高，促進破骨細胞的增殖與活化，而破骨細胞凋亡及白細胞介素受體I型(Interleukin-1 Receptor I Type，IL-1RI)表達卻下降，表現為骨重塑提高，骨吸收增加[2]。骨關節(jié)炎中，異常激活的成骨細胞和破骨細胞可引起軟骨下骨的骨重塑，同時逆向影響上層軟骨生物力學環(huán)境，進而導致上層軟骨的退變。軟骨下骨的修復與重塑取決于骨吸收與骨形成的平衡，在破骨細胞形成的同時成骨細胞也在增殖及分化。Sanchez等[3]對OA患者軟骨下骨硬化區(qū)和非硬化區(qū)的成骨細胞施加大小為1MPa、頻率為1Hz的周期性壓應力，持續(xù)4h，結果RANKL和MMPs的表達均增加。但是，由于破骨細胞研究條件的局限性，骨關節(jié)炎中的破骨細胞影響軟骨下骨重塑的作用機制，仍有待進一步研究。

2 破骨細胞與力學信號轉導途徑

2.1 破骨細胞的起源及信號調節(jié)通道 破骨細胞來源于造血干細胞的單核巨噬細胞譜系[4]，在骨吸收過程中起著非常重要的作用。研究發(fā)現，骨保護素(Osteoprotegerin,OPG) 是調控成骨細胞功能活動的重要分子，破骨細胞分化因子(Osteoclast Ddifferentiation Factor,ODF)是調控破骨細胞功能活動的重要分子。ODF又稱為細胞核因子kB受體活化因子配體(Receptor Activator for Nuclear Factor-κ B Ligand RANKL),主要由成骨細胞合成,RANKL與破骨細胞表面的受體--細胞核因子κB 受體活化因子(Receptor Activator of Nuclear Factor-κB，RANK)結合可增加破骨細胞的增殖，增加骨吸收。OPG/RANKL/RANK通路是成骨細胞與破骨細胞之間相互作用的信號通道，可調控骨吸收。OPG主要由間充質干細胞和成骨細胞合成和分泌,具有增加骨密度、抑制破骨細胞活性和降低破骨細胞分化的功能[5]，含有5 個外顯子，其與腫瘤壞死因子受體(Tumor Necrosis Factor Receptor，TNF)的編碼蛋白類似，屬于TNF受體超家族。研究表明，OPG 基因被敲除的小鼠有骨小梁和骨皮質減少、骨質疏松嚴重等癥狀同時伴有OPG 轉基因過度表達的小鼠則會出現骨硬化癥[6]。RANKL是一種三聚體Ⅱ型跨膜蛋白，由317 個氨基酸構成，廣泛表達于淋巴細胞、軟骨細胞和成骨細胞中[7]。人類RANKL基因主要表達于骨髓、骨及淋巴組織。RANKL可結合破骨細胞表面受體RANK，具有促進破骨細胞分化、生成、活化成熟的作用，進而破壞骨質。 RANK屬于TNF超家族成員，是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，由616個氨基酸組成。RANK編碼基因由29個氨基酸信號肽、細胞外編碼區(qū)183 個氨基酸、跨膜區(qū)21個氨基酸和細胞質區(qū)383個氨基酸組成[8]。OPG可以通過競爭性地結合RANKL，阻礙RANKL與RANK結合，抑制破骨細胞活性，阻礙骨吸收。因此OPG/RANK/RANKL調節(jié)軸對于破骨細胞分化及骨重建的耦聯作用非常關鍵。

2.2 力學刺激與OPG/RANKL/RANK信號通路 力學刺激作用于細胞后，細胞可通過細胞外基質-整合素-細胞骨架系統(tǒng)、鈣離子通道、G 蛋白與酪氨酸激酶等多種途徑將細胞外物理性的應力信號轉變?yōu)榧毎麅鹊幕瘜W信號，傳導至細胞核內，細胞核內的相關基因被活化，調控合成一些細胞因子，起到調控細胞增殖、分化、凋亡的作用。大量研究表明，OPG/RANKL/RANK信號通路是力學敏感通路[9]。在OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)中，骨髓基質及成骨細胞在分泌RANKL使破骨細胞分化、促進骨吸收的同時也會分泌一定量的OPG 以防止骨過度吸收。OPG/RANKL比值下降時破骨細胞活性增強，骨吸收增加[10]。適宜的機械應力刺激和運動能促進OPG的表達，提高OPG/RANKL比例，有利于促進骨骼生長[11]。Boreham等[12]發(fā)現，有規(guī)律的耐力運動能使骨量明顯增加1%～6%，提高成骨細胞活性，促進骨形成；而過度運動則抑制OPG 的表達，上調RANKL表達，OPG/RANKL比例下降，增強破骨細胞活性，導致骨微損傷[13]。這些實驗都說明中等強度的應力刺激可引起OPG/RANKL比值升高，有利于促進骨形成；而大強度的應力刺激則引起OPG/RANKL比值下降，不利于骨骼發(fā)展。

3 力學刺激對破骨細胞的作用

3.1 機械應力抑制破骨細胞分化 骨骼處于動態(tài)發(fā)展狀態(tài)，骨重建與修復均與生理或外加力學刺激相關，其中由成骨細胞與破骨細胞主導的骨形成和骨吸收在整個過程中保持動態(tài)平衡[14-15]。成骨細胞與破骨細胞密切相關，研究發(fā)現[16]，利用成骨細胞和破骨前體細胞共培養(yǎng)可誘導出更多的破骨細胞和高水平的Notch2表達，為進一步破骨細胞功能實驗奠定基礎。大量研究證實[17-19]，機械應力可直接抑制破骨細胞分化，并通過下調ODF及RANKL、MMP-9、組織蛋白酶-K、降鈣素受體等骨吸收標志物的mRNA表達，上調內源性一氧化氮合酶(Endogenous Nitric Oxide Synthase，eNOS)mRNA表達，起到抑制骨吸收的作用。研究發(fā)現[20-21]，應力刺激可抑制破骨細胞分化，進而防止軟骨及軟骨下骨的退化，起到治療關節(jié)炎的作用。力學刺激能通過骨細胞、成骨細胞間接調控破骨細胞的增殖及活性，且能直接作用于破骨細胞并產生生物效應，1000μs大小的循環(huán)壓力可以增強成骨細胞的活性，同時促進BMSCs向成骨細胞分化，并抑制破骨前體細胞RAW264.7向破骨細胞分化。力學刺激會改變RANK與RANKL的結合度，從而抑制破骨細胞成熟、分化，減少骨吸收，其是調節(jié)破骨細胞增殖與分化的主要因子。巫松輝等[22]發(fā)現復合振動能通過抑制RANKL 誘導破骨細胞形成，下調破骨細胞特異基因組織蛋白酶K，MMP-9和TRAP的表達，達到抑制骨吸收的作用。應力刺激還可通過下調IL-1、TNF-α等炎性因子及TRAP、ODF、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、RANKL等骨吸收因子的表達，降低破骨細胞的增殖及分化能力，進而抑制骨吸收。Nagatomi等[23]發(fā)現周期性機械壓力能下調IL-1及TNF-α等促進破骨細胞分化的細胞因子的基因表達，顯著抑制骨吸收。但是，在目前環(huán)境下研究成骨細胞的相關量化條件是否適用于破骨細胞，仍有待進一步觀察。

3.2 不同大小的力學刺激對破骨細胞的不同作用 骨的修復與重建需要力學刺激的參與，不同大小的力學刺激對于破骨細胞的作用不同。陳國仙等[24]觀察不同頻率振蕩應力(3～10Hz、15～35Hz、35～45Hz、50～70Hz 和70～90Hz)分別作用于體外誘導分化的RAW264.7細胞，發(fā)現不同振動頻率組破骨細胞特異性基因(TRAP、MMP-9和CATK)表達水平逐漸減低，而B、C、D組中OPG基因表達逐漸上調，同時RANKL基因的表達逐漸下調，說明RAW264.7細胞不同程度地被抑制向成熟破骨細胞增殖分化。劉應芬等[25]研究發(fā)現， 16.08dyne/cm2的剪切力作用30min可使TRAP活性最強，同時通過掃描電鏡觀察發(fā)現吸收陷窩的面積和數量均有較為明顯的提升，促進了破骨細胞的吸收活性。力學環(huán)境是影響骨組織細胞增殖、分化和凋亡的重要因素，許多學者在骨的生物學和力學方面做了大量研究工作。2500 με被認為是生理范圍內的應變，3000～5000με是生理性過載應變，生理性過載應變水平下長期循環(huán)加載或超過5000με為病理過載，會引起病理性骨重塑與重建。在一定的作用時間內，較高強度的生理載荷促進破骨細胞分化和功能，低強度載荷抑制破骨細胞分化，病理性載荷抑制破骨細胞分化[26]。研究還發(fā)現，不同強度周期性應變力對分化初期破骨前體細胞和已分化的破骨前體細胞的破骨分化和功能狀態(tài)的影響有明顯差異，2500με的周期性應變力可顯著抑制成骨細胞+破骨細胞共培養(yǎng)體系中破骨細胞的分化功能，減少骨吸收[27]。

4 展望

力學刺激改善骨修復的可能途徑為一定大小及頻率的應力上調OPG、IFN等成骨因子的表達以促進骨形成，同時下調RANKL等骨吸收因子的表達抑制骨吸收。有關應力信號如何分別影響和交互影響骨形成和骨吸收過程從而影響軟骨下骨的作用機制還有待進一步的探索和研究。因此，研究通過適宜應力刺激調節(jié)或直接靶向干預破骨細胞及OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)來治療骨關節(jié)炎既是機遇又是挑戰(zhàn)。

[1] Castaneda S,Roman-Blas JA, Largo R, et al. Subchondral bone as a key target for osteoarthritis treatment. Biochem Pharmacol, 2012, 83(3): 315-323.

[2] Durand M, Komarova SV, Bhargava A,et al. Monocytes from patients with osteoarthritis display increased osteoclastogenesis and bone resorption: the In Vitro Osteoclast Differentiation in Arthritis study [J]. Arthritis Rheum, 2013, 65(1): 148-158.

[3] Sanchez C, Pesesse L, Gabay O, et al. Regulation of subchondral bone osteoblast metabolism by cyclic compression [J]. Arthritis Rheum, 2012, 64(4):1193-1203.

[4] 田雪飛.破骨細胞的來源[J].國外醫(yī)學: 口腔醫(yī)學分冊,2002,29(4): 354-356.

[5] Harada S, Takahashi N. Control of bone resorption by RANKL-RANKsystem [J]. Clinical calcium,2011, 21(8): 1121-1130.

[6] Dempster DW, Lambing CL, Kostenuik PJ, et al. Role of RANK ligand and denosumab, a targeted RANK ligand inhibitor, in bone health and osteoporosis: a review of preclinical and clinical data [J]. Clin Ther, 2012, 34(3): 521-536.

[7] Ryser MD,Qu Y, Komarova SV. Osteoprotegerin in bone metastases: mathematical solution to the puzzle [J]. PLoS computational biology, 2012, 8(10):1-12.

[8] Anastasia P, Ioannis P, Kelly M, et al. High levels of synovial fluid osteoprotegerin(OPG) and increased serum ratio of receptor activator of nuclear factor- kB ligand (RANKL) to OPG correlate with disease severity in patients with primary knee osteoarbritis [J]. Clin Biochem,2008, 41(9): 746-749.

[9] Zhang Y, Paul EM, Sathyendra V, et al. Enhanced osteoclastic resorption and responsiveness to mechanical load in gap junction deficient bone [J]. PLoS One, 2011, 6(8): 1-12.

[10]Novack DV. Role of NF-kappaB in the skeleton[J]. Cell Res,2011, 21(1) : 169-182.

[11]Thompson WR, Rubin CT, Rubin J. Mechanical regulation of signaling pathways in bone[J]. Gene, 2012, 503(2) : 179-193.

[12]Boreham CA,Mckay HA. Physical activity in childhood and bone health [J]. British journal of sports medicine, 2011,45(11) : 877-879.

[13]Mulcahy LE, Taylor D, Lee TC, et al.RANKL and OPG activity is regulated by injury size in networks of osteocyte-like cells[J].Bone,2011,48(2) : 182-188.

[14]廖乃順,陳文列,黃云梅,等.成骨細胞與破骨細胞共培養(yǎng)及其應用研究進展[J].中國骨傷,2013,26(4):349-353.

[15]Takano Yamamoto T.Osteocyte function under compressive mechanical force[J].Jap Dental Sci Rev,2014,50(2):29-39.

[16]段莉,鄭根建.兩種不同細胞培養(yǎng)方法對破骨細胞分化及Notch2基因表達的影響[J].海南醫(yī)學院學報, 2012,18 (8) :1009-1012.

[17]Rubin J, Murphy T, Nanes MS, et al. Mechanical strain inhibits expression of osteoclast differentiation factor by murine stromal cells [J]. AmeJ Physiol Cell Physiol, 2000, 278(6) : 1126-1132.

[18]Rubin J, Murphy TC, Zhu L, et al. Mechanical strain differentially regulates endothelial nitric-oxide synthase and receptor activator of nuclear kappa B ligand expression via ERK1 /2 MAPK[J].J Biol Chem,2003,278(36) : 34018-34025.

[19]Suzuki N, Yoshimura Y, Deyama Y, et al. Mechanical stress directly suppresses osteoclast differentiation in RAW264. 7 cells[J].Int J Mol Med, 2008, 21(3) : 291-296.

[20]Xinle Li, Jing Yang, Daquan Liu, et al. Knee loading inhibits osteoclast lineage in a mouse model of osteoarthritis[J].Scientific reports,2016,20(6):24668-24672.

[21]Guo Y, Wang Y, Liu Y,et al.Effect of the same mechanical loading on osteogenesis and osteoclastogenesis in vitro[J].Chin J Traumatol,2015,18(3):150-156.

[22]巫松輝,鐘招明,查丁勝,等.復合振動抑制RAW264.7 細胞分化成熟[J].中國骨質疏松雜志,2011,17(7): 564-567.

[23]Nagatomi J, Arulanandam BP, Metzger DW, et al. Effects of cyclic pressure on bone marrow cell cultures [J]. J Biomechan Eng, 2002, 124(3) : 308-314.

[24]陳國仙,陳建庭,黃文華,等.不同頻率振動應力對破骨細胞特異性基因及骨保護素/核因子κB 受體活化因子配體表達的影響[J].中國康復醫(yī)學雜志,2014,29(2):99-103.

[25]劉應芬,李紅,吳江,等.流體剪應力對大鼠破骨細胞骨吸收活性的影響[J].生物醫(yī)學工程學雜志,2007,24(3) :544-548.

[26]郭勇,郭春,閆玉仙,等. 周期性張應變對破骨前體細胞和破骨細胞增殖和抗酒石酸酸性磷酸酶的影響[J]. 醫(yī)用生物力學,2012,27(3):29-304.

[27]YAN YX,GONG YW,Guo Y,et al.Mechanical strain regulates osteoblast proliferation through integrin mediated ERK activation[J].PLoS ONE,2012,7(4):35709-35715.