氫氣對重度膿毒癥小鼠腸道損傷的保護作用*

史 媛，謝克亮，于泳浩，王 濤（天津醫科大學總醫院麻醉科，天津300052）

氫氣對重度膿毒癥小鼠腸道損傷的保護作用*

史 媛，謝克亮，于泳浩，王 濤
（天津醫科大學總醫院麻醉科，天津300052）

目的觀察氫氣吸入對重度膿毒癥小鼠腸黏膜屏障功能、腸道組織氧化還原狀態的影響，并探討其機制。方法選取美國癌癥研究所雄性小鼠56只，體質量20～25 g，均為5周齡，采用隨機數字表法將其分為四組：假手術組（A組）、假手術+氫氣組（B組）、膿毒癥組（C組）和膿毒癥+氫氣組（D組），每組14只。采用盲腸結扎穿孔（CLP）法制備小鼠膿毒癥模型。B組和D組于CLP后1、6 h吸入2%氫氣1 h。CLP后24 h進行行為學評分；采集靜脈血檢測血中生化指標[丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）]；隨后處死小鼠取中段空腸，對腸道組織進行原位末端脫氧核苷酸轉移酶標記法（TUNEL）染色，觀察腸道組織細胞凋亡情況并評分；檢測血液及腸道組織勻漿中丙二醛（MDA）水平及過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）的活力。結果與A組比較，C組和D組行為學評分、腸道組織凋亡指數、血生化指標（ALT、AST、BUN、Cr）水平及血清和腸道組織MDA水平升高，SOD和CAT活力降低，差異均有統計學意義（P＜0.05），而B組上述指標與A組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；與C組比較，D組行為學評分、腸道組織凋亡指數、血生化指標水平及血清和腸道組織MDA水平降低，SOD和CAT活力升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論氫氣吸入對重度膿毒癥小鼠腸損傷和腸黏膜屏障功能破壞有明顯保護作用，可能與其抗凋亡作用及對內源性氧化還原平衡狀態的維持有關。

膿毒癥； 腸黏膜； 氫； 氧化性應激； 腸； 細胞凋亡

膿毒癥是臨床上常見的一種復雜的綜合征，病理生理特征為炎癥系統過度激活所導致的全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）、氧化應激損傷、高凝狀態、組織低灌注導致的全身組織缺氧、代償性抗炎反應綜合征及最終階段的多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction，MODS）[1]。越來越多的研究表明，活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的過量產生及抗氧化防御系統功能的降低在膿毒癥的發病過程中起著重要作用[1]。因此，近來研究者們將膿毒癥治療的重點從控制失控的炎性反應轉移到對ROS的清除和機體氧化還原平衡的維持方面。

腸道組織在腸腔內容物與機體之間形成2層屏障：物理/解剖屏障和免疫屏障。物理屏障是由一層互相聯結在一起的上皮細胞構成，上皮細胞與固有層共同構成腸道黏膜層[2-3]。腸道黏膜一方面負責腸腔內營養物質的吸收，同時把腸腔內多種有毒的物質與身體隔離開。腸道組織內這一微妙的平衡機制的破壞是多種疾病發生的基礎[4]。大量動物實驗研究已經證實，腸道屏障功能破壞能造成腸腔內抗原、微生物和有害代謝產物向血循環中移位，在多種炎癥性疾病的發病過程中起到重要作用，如手術后或創傷后SIRS、膿毒癥和MODS[5-9]。前期的研究已經證實，膿毒癥中即使通過控制血流的方法改善組織氧合，腸道組織仍是極易受累的器官[5-6]。腸道功能的改變在膿毒癥的發生發展中發揮著重要作用，受損的腸道組織通過促進病原微生物的侵襲及細菌毒性代謝產物的移位，在SIRS的發生中起著重要的推動作用[7-8]，從而產生了一種新的理論——腸道是膿毒癥發病的動力器官[10]。因此，膿毒癥患者腸道功能的改變受到特別重視，而腸黏膜屏障功能失調是膿毒癥患者最常見的腸道并發癥[11]。腸黏膜屏障功能失調可以促進腸道菌群的異常增殖和細菌異位，導致二重感染和MODS的發生[12]。腸黏膜屏障功能失調的機制可能包括膿毒癥全身炎癥細胞的異常激活與促炎性細胞因子的大量釋放，氧自由基的大量產生造成氧化應激狀態[11]，這也是造成膿毒癥患者MODS、膿毒性休克甚至死亡的重要原因。因此，針對腸黏膜屏障功能失調的有效治療措施有可能為臨床膿毒癥患者的治療帶來新的希望。

本研究擬利用盲腸結扎穿孔（CLP）法誘導的小鼠重度膿毒癥模型，通過全身各主要臟器生化指標[丙二醛（MDA）水平及超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活力]的測定證實膿毒癥全身損傷的存在，在此基礎上給予2%氫氣吸入治療，以明確氫氣的抗氧化特性及對機體內源性抗氧化系統功能的影響在模型中發揮的治療作用。并重點觀察給予氫氣治療后重度膿毒癥小鼠模型中腸道組織的病理變化和細胞凋亡情況，并進一步探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 選取美國癌癥研究所雄性小鼠56只，體質量20～25 g，均為5周齡（購自中國軍事醫學科學院實驗動物中心）。置于清潔環境中，分籠飼養，自由進食，飲自來水，標準飼料喂養，室溫18～22℃，相對濕度60%～80%，自然晝夜光線照明，常規飼養觀察1周后使用。采用隨機數字表法將其分為四組：假手術組（A組）、假手術+氫氣組（B組）、膿毒癥組（C組）及膿毒癥+氫氣組（D組），每組14只。

1.1.2 模型建立 參照文獻[13]采用CLP法制備小鼠膿毒癥模型。腹腔注射2%水合氯醛15 mL/kg麻醉，常規腹部聚維酮碘消毒，備皮，鋪無菌洞巾。沿小鼠腹正中線切口約1 cm，用無菌鑷探查到盲腸后，用手術縫線在回盲瓣下方盲腸近段1/4處結扎盲腸（避免結扎回腸及盲腸系膜血管），用20 G無菌針頭貫通穿刺盲腸，擠壓盲腸，使其內容物沿穿孔部位擠出0.3 mL，將盲腸還納腹腔，逐層關腹。A組和B組僅暴露盲腸。

1.2 方法

1.2.1 氫氣治療 采用GCH-300高純氫氣發生器（天津同普分析儀器科技有限公司）提供氫氣，將小鼠放入密閉的樹脂玻璃箱內，入氣口輸入4 L/min的氫氣和空氣混合氣，PG610氫氣檢測儀（河南英特電器設備公司）監測箱內氫氣濃度[14]。B、D組于CLP后1、6 h時吸入2%氫氣1 h，A、C組小鼠僅放于玻璃箱內，不吸入氫氣。

1.2.2 行為學評分 每組各任選7只小鼠，CLP后24 h進行結膜炎、毛發豎立、腹瀉、昏睡程度評分，各項得分為0～3分：0分為無，1分為輕度，2分為中度，3分為重度，總分12分。

1.2.3 血清和腸道組織中MDA、CAT及SOD測定 每組各取7只小鼠采取血漿。方法：沿胸骨正中作一切口，進入胸腔，暴露心臟滿意后，將一預先肝素化的1 mL空針刺入左心室，取血1 mL，迅速在4℃、3 000 r/min離心10 min。離心后，取上清液裝入凍存管，-80℃冰箱中保存直至氧化指標的測定。采集血樣后，處死小鼠取小腸組織勻漿，4℃、10 000 r/min離心15 min，取上清液，同樣方法冷凍保存。用分光光度法測定MAD、SOD及CAT（試劑盒購自Cayman Chemical公司），嚴格按照說明書操作。

1.2.4 血生化指標和腸道組織細胞凋亡指數測定 每組取剩下的7只小鼠采取全血，方法與血漿的采取方法類似，從左心室取血成功后，立即進行生化指標[丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）]測定。處死小鼠取小腸組織，用10%甲醛固定6 h，石蠟包埋，制備5 μm厚切片，固定于玻片上。操作流程為制作石蠟切片，切片常規脫蠟，復水；后續過程在濕盒內進行，先用0.5%過氧化氫的磷酸鹽緩沖液（PBS）封閉內源過氧化物酶活性，然后將切片在緩沖鹽溶液（SSC）中浸泡2次，每次20 min，水溫80℃，浸泡后用PBS洗2次；室溫下用1～2 μg/mL蛋白酶K的10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液（pH=8.0）處理玻片10 min，再用PBS清洗3次；之后用補充有150 mmol/L氯化鈉的原位末端脫氧核苷酸轉移酶標記法（TUNEL）反應緩沖液預孵育切片10 min；加TUNEL反應液后，用熒光顯微鏡觀察并拍照。凋亡細胞核呈綠色熒光，即為TUNEL陽性細胞，正常細胞核無綠色熒光。每張切片隨機選取10個不重疊的視野，計算每張切片10個視野的總細胞數和總凋亡細胞數，計算每張切片的凋亡指數（10個視野的總凋亡細胞數占總細胞數的百分比），DeadEndTM熒光測定TUNEL試劑盒購自美國Promega公司。

1.3 統計學處理 應用SPSS 15.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 四組小鼠行為學評分及腸道組織凋亡指數比較 與A組比較，C組和D組行為學評分升高，腸道組織凋亡指數升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；而B組上述指標與A組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；與C組比較，D組行為學評分和腸組織凋亡指數降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 四組小鼠行為學評分及腸組織凋亡指數比較（±s）

表1 四組小鼠行為學評分及腸組織凋亡指數比較（±s）

注：與A組比較，aP＜0.05；與C組比較，bP＜0.05。

組別n 行為學評分（分） 腸組織凋亡指數（%）A組B組C組D組7 7 7 7 0.20±0.40 0.20±0.40 9.00±0.60a4.70±2.40ab2.70±0.80 2.30±1.00 61.80±10.90a28.80±6.70ab

2.2 四組小鼠血生化指標水平比較 與A組比較，C組和D組小鼠的ALT、AST、BUN、Cr水平均明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；B組上述各項指標與A組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；與C組比較，D組ALT、AST、BUN、Cr水平均降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 四組小鼠血生化指標水平比較（±s）

表2 四組小鼠血生化指標水平比較（±s）

注：與A組比較，aP＜0.05；與C組比較，bP＜0.05。

T（U/L） BUN（mmol/L）Cr（μmol/L）C組D組7 7 81.33±6.18a21.77±5.02ab3±11.24 7±8.69 336.17±13.80a104.15±15.52ab5.85±1.35 5.84±0.41 20.18±1.85a8.62±1.26ab30.90±4.39 30.93±3.55 90.77±7.60a40.28±7.46ab

2.3 四組小鼠血清與腸道組織MDA水平、CAT及SOD活力比較 與A組比較，C組和D組小鼠血清及腸組織MDA水平升高，SOD和CAT活力降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；B組上述各指標與A組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；與C組比較，D組血清及腸組織MDA水平降低，SOD和CAT活力升高，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 四組小鼠血清與腸組織MDA、CAT及SOD水平比較（±s）

表3 四組小鼠血清與腸組織MDA、CAT及SOD水平比較（±s）

注：與A組比較，aP＜0.05，與C組比較，bP＜0.05。

組別n 血清MDA（nmol/mL） SOD（U/mL） CAT（U/mL）A組B組C組D組7 7 7 7 1.85±0.17 1.84±0.36 3.64±0.25a2.50±0.22ab91.67±8.98 93.33±4.04 72.15±4.47a87.01±4.66ab24.33±3.77 24.87±3.76 10.49±3.25a16.62±2.86ab組別n 腸組織MDA（nmol/mL） SOD（U/mL） CAT（U/mL）A組B組C組D組22.49±1.17 22.29±2.63 14.92±2.63a19.01±1.48ab7 7 7 7 2.98±0.18 2.92±0.24 4.61±0.32a3.13±0.23ab178.98±7.43 181.29±8.35 87.10±6.25a126.39±7.39ab

3 討 論

本研究通過CLP法制備小鼠膿毒癥模型觀察氫氣吸入對重度膿毒癥小鼠腸黏膜屏障功能、腸道組織氧化還原狀態的影響，結果顯示，CLP后小鼠行為學評分降低，生化指標出現異常，表明膿毒癥模型制備成功；CLP后腸道組織凋亡指數升高，提示膿毒癥誘發腸道損傷模型制備成功。

本課題組前期研究表明，CLP后1、6 h吸入2%氫氣1 h可提高膿毒癥小鼠生存率[14]，故本研究選擇CLP后1、6 h吸入2%氫氣1 h。結果表明，吸入氫氣后，膿毒癥小鼠行為學評分和相關血生化指標降低，腸道凋亡指數降低，表明氫氣減輕了小鼠膿毒癥誘發的腸黏膜損傷。

有研究已經證明，在膿毒癥的發展過程中，腸道是極易受累的器官[5-6]。受損的腸道組織通過促進腸腔內抗原、微生物和有害代謝產物向血循環中移位，在SIRS的發生中起著重要的推動作用[7-8]，進而產生了一種新的觀點——腸道是膿毒癥病程進展的動力器官[10]。因此，膿毒癥患者腸道功能的改變受到越來越多的重視，而腸黏膜屏障功能受損是膿毒癥患者最常見的腸道并發癥[11]。腸黏膜屏障功能失調可以促進腸道菌群的異常增殖和細菌異位，導致二重感染和MODS的發生[12]。Doig等[15]在危重癥患者中開展的一項前瞻性隊列研究證實，腸黏膜屏障功能缺陷與重癥患者MODS的發生及預后存在顯著相關性。腸黏膜屏障功能損傷的機制可能包括膿毒癥患者全身炎癥細胞的異常激活與促炎性細胞因子的大量釋放，氧自由基的大量產生可造成氧化應激狀態[11]，這也是造成膿毒癥患者MODS、膿毒性休克甚至死亡的重要原因。

生理情況下，由于線粒體電子逸出或還原型輔酶Ⅱ、黃嘌呤氧化酶等氧化酶的作用，機體內不斷產生具有生理活性的ROS，如超氧離子、過氧化氫等[16]，在機體內發揮重要的生理功能；并且能夠被SOD、CAT、谷胱甘肽等抗氧化酶類及時清除[17]。在膿毒癥的眾多發病機制中，氧自由基損傷扮演著重要角色。膿毒癥時可激活中性粒細胞、單核/巨噬細胞等產生大量的ROS。有害的ROS大量堆積，通過多種途徑對機體造成損傷，直接導致生物膜損傷和各種功能障礙，破壞細胞膜，進而加劇細胞凋亡活動，導致DNA嚴重損傷，使DNA鏈發生難以修復的斷裂，最終導致細胞死亡。本實驗通過測定脂質過氧化產物MDA水平來反映機體氧化應激狀態，結果在膿毒癥模型組腸組織中發現MDA水平明顯增高，氫氣吸入后這種增高趨勢被抑制，說明腸道組織氧化損傷的存在，以及氫氣對有害自由基的選擇性清除作用[13]。而抗氧化酶（CAT、SOD等）可以減輕氧化應激對組織、細胞及微結構造成的損傷。從本實驗不難看出，與假手術組相比，重度膿毒癥小鼠血清及腸組織中SOD和CAT活力顯著降低。

綜上所述，氫氣通過對ROS的選擇性清除、對細胞凋亡的抑制，以及對機體抗氧化防御系統的激活，在膿毒癥腸道損傷中發揮保護作用。

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Protective effects of hydrogen on intestinal injury in septic mice*

Shi Yuan，Xie Keliang，Yu Yonghao，Wang Tao
（Department of Anesthesiology，General Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin 300052，China）

ObjectiveTo investigate the effect of hydrogen（H2）inhalation on the intestinal barrier function and intesti nal tissue redox status in severe septic mice and its mechanism.MethodsFifty-six male mice of the American Institute for Cancer Research（AICR）were selected，the body mass was 20-25 g and aged 5 weeks，and divided into four groups according to the random number table method：sham operation group（group A），sham operation+H2group（group B），sepsis group（group C）and sepsis+H2group（group D），14 cases in each group.The mouse sepsis model was produced by cecal ligation and puncture（CLP）method.The group B and D received 1 h inhalation of 2%H2at 1 and 6 h after CLP.The behavioral score was conducted at 24 h after CLP；the venous blood was collected for detecting blood biochemical indicators（ALT，AST，BUN，Cr），then the mice were sacrificed for taking the middle section of jejunum.The intestinal tissue was performed the TUNEL staining for observing the apoptosis situation of intestinal tissue cells and conducting the scoring；the levels of MDA and activity of CAT and SOD in blood and intesti nal tissue homogenate were detected.ResultsCompared with the group A，the behavioral score，intestinal tissue apoptosis index，levels of blood biochemical indicators（ALT，AST，BUN，Cr）and serum and intestinal tissue MDA level in the group C and D were increased，while the activityofSOD and CAT were decreased，the differences were statistically significant（P＜0.05），but which in the group B had no statistical differences as compared with the group A（P＞0.05）；compared with the group C，the behavioral score，intestinal tissue apoptosis index，levels of blood biochemical indicators and serum and intestinal tissue MDA level in the group D were decreased，while the activity of SOD and CAT were increased，the differences were statistically significant（P＜0.05）.ConclusionH2inhalation has obviously protective effect on intestinal injury and intestinal mucosal barrier function destroy in severe septic mice，which may be associated with the anti-apoptotic effect and maintaining endogenous redox equilibrium state.

Sepsis； Intestinal mucosa； Hydrogen； Oxidative stress； Intestines； Apoptosis

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.24.003

：A

：1009-5519（2016）24-3747-04

2016-09-13）

國家自然科學基金資助項目（81071533，81101409）。

史媛（1986-），碩士研究生，主要從事臨床重癥醫學與麻醉學研究。