取樣時(shí)間和消毒方法對(duì)青錢柳莖段腋芽誘導(dǎo)的影響

王 紀(jì)，楊 靜， 楊萬霞，方升佐*

(1.南京曉莊學(xué)院，江蘇南京 211171；2.南京林業(yè)大學(xué)，江蘇南京 210037)

取樣時(shí)間和消毒方法對(duì)青錢柳莖段腋芽誘導(dǎo)的影響

王 紀(jì)1，楊 靜2， 楊萬霞2，方升佐2*

(1.南京曉莊學(xué)院，江蘇南京 211171；2.南京林業(yè)大學(xué)，江蘇南京 210037)

[目的]解決青錢柳組織培養(yǎng)過程中外植體污染問題。[方法]以青錢柳帶腋芽的莖段為材料，研究不同取樣時(shí)間和消毒方法對(duì)青錢柳莖段腋芽萌發(fā)率的影響。[結(jié)果]最佳采樣時(shí)間為4、5月，最優(yōu)消毒處理分別為70%乙醇30 s + 0.10%升汞12 min(4月)和70%乙醇30 s + 0.05%升汞16 min(5月)。[結(jié)論]試驗(yàn)結(jié)果為建立青錢柳的無性快繁體系奠定了基礎(chǔ)。

青錢柳；取樣時(shí)間；消毒；腋芽誘導(dǎo)

青錢柳的組織培養(yǎng)工作已受到眾多科研工作者的重視[1]，建立優(yōu)良的無性系繁殖體系對(duì)于保存青錢柳的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源具有重大意義。通過以芽繁芽的方式增殖，具有取材方便、直接，減少變異，成苗速度快等優(yōu)點(diǎn)，能保持母樹優(yōu)良性狀，并可以克服離體胚培養(yǎng)和愈傷組織再生途徑不能保持母本優(yōu)良特性的缺點(diǎn)[2-5]。但就青錢柳目前的研究情況來看，大部分處于初步探索階段[6-10]。要建立青錢柳的快繁體系，解決外植體污染問題成為青錢柳腋芽誘導(dǎo)的關(guān)鍵。鑒于此，筆者研究了外植體采樣時(shí)間和消毒方法對(duì)青錢柳莖段腋芽誘導(dǎo)的影響，以期為建立青錢柳的無性快繁體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 南京林業(yè)大學(xué)校園6年生青錢柳母樹當(dāng)年生嫩枝。

1.2 方法

1.2.1 材料處理及不同消毒方法的篩選。取當(dāng)年生青錢柳的嫩枝條，剪去葉片，切成2 cm左右的帶腋芽莖段，流水沖去表面臟物，再用飽和的洗潔精溶液搖動(dòng)浸泡5 min，去除外植體表面的塵土和部分菌體，流水沖洗1～2 h，瀝水后進(jìn)行消毒滅菌處理(表1)。各處理完成后，均用無菌水沖洗8～10次，切去兩端褐變部分，接種到培養(yǎng)基進(jìn)行腋芽誘導(dǎo)，每瓶接種2個(gè)莖段，每個(gè)處理接20瓶。接種后定期觀察，及時(shí)取出污染莖段，對(duì)未污染莖段進(jìn)行轉(zhuǎn)接。每次接種后20 d統(tǒng)計(jì)污染率，30 d統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。

1.2.2 培養(yǎng)方法。基本培養(yǎng)基均為WPM培養(yǎng)基，附加不同濃度的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和Vc，蔗糖3.0%，瓊脂0.6%，培養(yǎng)基pH調(diào)至5.8；121 ℃高壓滅菌20 min；培養(yǎng)溫度25 ℃；光照強(qiáng)度2 000 lx；光期14 h，暗期10 h；相對(duì)濕度50%～70%。

表1 不同消毒方法正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L4(23)及實(shí)施方案

Table 1 Orthogonal design L4(23)and implementary scheme of different disinfection methods

處理號(hào)TreatmentNo．試驗(yàn)設(shè)計(jì)ExperimentaldesignABC實(shí)施方案Implementaryscheme70%乙醇處理時(shí)間Treatmenttimeof70%alcohol∥s升汞濃度Concentrationofmercuricchloride∥%升汞處理時(shí)間TreatmenttimeofmercuricchlorideminM1111150．0512M2122150．1016M3212300．0516M4221300．1012

1.2.3 數(shù)據(jù)處理。利用Excel軟件處理圖表；利用DPS數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行方差分析，并進(jìn)行Duncan’s差異顯著性檢驗(yàn)，判定試驗(yàn)效應(yīng)的顯著性。

污染率=污染莖段數(shù)/接種的莖段數(shù)×100%

萌芽率=腋芽萌動(dòng)莖段數(shù)/接種的莖段數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 取樣時(shí)間和消毒方法對(duì)青錢柳莖段污染率的影響 將處理過的青錢柳外植體接種到培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)后，4—8月青錢柳莖段外植體污染率最低的分別是M2處理、M3處理、M2處理、M4處理、M2處理，與其他處理間差異都達(dá)到極顯著水平。12月青錢柳莖段4個(gè)消毒處理的污染率均較高，分別達(dá)100%、100%、98.00%、92.00%，差異不顯著(表2和圖1)。

2.2 取樣時(shí)間和消毒方法對(duì)青錢柳莖段腋芽誘導(dǎo)率的影響 由表3可知，4—7月青錢柳莖段都有萌芽的能力，4月腋芽誘導(dǎo)率最高的是M1處理，達(dá)51.43%，其次是M2、M4處理，兩者萌芽率差異不顯著；而8月以后的莖段腋芽誘導(dǎo)率為0，這可能是8月以后的青錢柳莖段已經(jīng)木質(zhì)化，體內(nèi)激素水平也不再適合腋芽的誘導(dǎo)。青錢柳莖段最好的消毒處理是M2，其次是M1。綜合各月的最高萌芽率可以看出，隨著月份的增加，青錢柳莖段腋芽的萌發(fā)率逐漸下降，以4月的萌芽率最高，5、6月差異不顯著，但較4月的腋芽誘導(dǎo)率降低，7月腋芽誘導(dǎo)率降低達(dá)到顯著水平，8月以后的莖段腋芽誘導(dǎo)率降為0。而污染率則是隨著月份的增加而提高，從4月的11.36%～44.44%增加到7月的66.07%～83.61%。分析可知，不同月份的青錢柳莖段要采用不同的消毒方法，取樣時(shí)間以4—7月為宜，最佳采樣時(shí)間為4、5月(圖2)。

表2 取樣時(shí)間和消毒處理對(duì)青錢柳莖段污染率的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同大、小字母分別表示不同處理間在0.01、0.05水平差異顯著。

Note：Different capital letters and lowercases at the same column indicated that there was significant difference at 0.01 and 0.05 level，respectively.

圖1 青錢柳莖段滅菌后不同類型的污染 Fig.1 Different pollution on disinfect stem of Cyclocarya paliurus

%

注：同列數(shù)據(jù)后不同大、小字母分別表示不同處理間在0.01、0.05水平差異顯著。

Note：Different capital letters and lowercases at the same column indicated that there was significant difference at 0.01 and 0.05 level，respectively.

注：a.4月青錢柳腋芽誘導(dǎo)；b.5月青錢柳腋芽誘導(dǎo)；c.6月青錢柳腋芽誘導(dǎo)；d.青錢柳莖段誘導(dǎo)出雙芽。Note：a.Axillary bud induction of Cyclocarya paliurus in April；b.Axillary bud induction of Cyclocarya paliurus in May；c.Axillary bud induction of Cyclocarya paliurus in June；d.Double bud induced from bud of Cyclocarya paliurus.圖2 青錢柳莖段腋芽誘導(dǎo)Fig.2 Axillary bud induction of Cyclocarya paliurus

2.3 不同月份青錢柳莖段消毒方法篩選 通過對(duì)青錢柳莖段各月污染率的極差分析(表4、5)，得到每月的最優(yōu)消毒處理分別為，4月：70%乙醇30 s + 0.1%升汞12 min(M4)；5月：70%乙醇30 s + 0.05%升汞16 min(M3)；6月：70%乙醇30 s + 0.1%升汞16 min；7月：70%乙醇30 s + 0.1%升汞12 min(M4)；這些處理并未全部包括在已設(shè)計(jì)的正交試驗(yàn)中，所以以后的試驗(yàn)可以參考上述結(jié)果再做調(diào)整。從極差分析結(jié)果還可看出，4、7月乙醇消毒時(shí)間對(duì)污染率影響最大，5、6、8月升汞濃度對(duì)污染率影響最大。而對(duì)不同取樣時(shí)間腋芽誘導(dǎo)率影響的主要因素也不同，4月對(duì)腋芽誘導(dǎo)率影響最大的是乙醇處理時(shí)間，5、7月是升汞濃度，6月對(duì)青錢柳腋芽誘導(dǎo)率影響最大的是升汞處理時(shí)間。

表4 取樣時(shí)間和消毒處理青錢柳莖段腋芽誘導(dǎo)率極差分析

表5 取樣時(shí)間和消毒處理青錢柳莖段污染率極差分析

3 結(jié)論與討論

青錢柳組織培養(yǎng)成功，其外植體的取樣和消毒是基礎(chǔ)和關(guān)鍵的一步。在青錢柳消毒試驗(yàn)和腋芽誘導(dǎo)的組織培養(yǎng)過程中，細(xì)菌性污染和真菌性污染都有出現(xiàn)[11-13]。該研究表明，對(duì)于材料表面的污染，通過不同濃度的乙醇和升汞即可控制，而對(duì)于外植體內(nèi)源菌的污染，可以嘗試在以后的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)南緞詼p少內(nèi)源菌帶來的污染。另外，也可通過取樣時(shí)間的控制來減少外植體的內(nèi)源菌攜帶。一般選擇4—6月青錢柳新抽出來枝條進(jìn)行試驗(yàn)，且采樣還應(yīng)該選擇晴朗天氣中午陽光較強(qiáng)時(shí)，此時(shí)的材料帶菌較少。

該試驗(yàn)結(jié)果表明，污染率是隨著月份的增加而提高，從4月的11.36%～44.44%增加到7月的66.07%～83.61%，12月的污染率能達(dá)100%。而從各月份的最高萌芽率可以看出，隨著月份的增加，青錢柳莖段腋芽的萌發(fā)率逐漸下降，以4月最高，8月以后的莖段腋芽萌發(fā)率降為0。污染率和萌芽率要求的消毒條件是互相矛盾的，低污染要求較高濃度和較長時(shí)間的乙醇和升汞處理，而高萌芽率則與該要求相反，需要低濃度和較短時(shí)間的乙醇和升汞處理。因此，消毒劑的濃度水平、消毒時(shí)間和取樣時(shí)間的選擇可以進(jìn)一步優(yōu)化組合，為青錢柳的組織培養(yǎng)提供更合適的消毒方法。

另外，隨著人們對(duì)環(huán)境污染的重視，升汞作為一種重金屬物質(zhì)且有毒，后續(xù)試驗(yàn)可以考慮將其替換成次氯酸鈉、吐溫等消毒劑[14-16]。

[1] 方升佐，洑香香.青錢柳資源培育與開發(fā)利用的研究進(jìn)展[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2007，31(1)：95-100.

[2] 謝寅峰，王瑩，尚旭嵐，等.青錢柳組培快繁體系的初步研究[J].西北植物學(xué)報(bào)，2009，29(11)：2331-2338.

[3] 尚旭嵐，徐錫增，方升佐.青錢柳離體胚的培養(yǎng)及快速繁殖[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2007，31(1)：101-105.

[4] 盛麗莉，史文亞，張志敏，等.青錢柳組織培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展[J].西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31(2)：84-88.

[5] 胡冬南，上官新晨，劉亮英，等.青錢柳莖段離體培養(yǎng)研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，48(6)：1300-1303.

[6] FANG S Z，YANG W X，CHU X L，et al.Provenance and temporal variations in selected flavonoids in leaves ofCyclocaryapaliurus[J].Food chemistry，2011，124(4)：1382-1386.

[7] 張志敏，尚旭嵐，王紀(jì)，等.消毒方法和培養(yǎng)基對(duì)青錢柳莖段腋芽萌發(fā)的影響[J].林業(yè)科技開發(fā)，2010，24(3)：87-90.

[8] 魯萌，阮氏釧，王紀(jì)，等.青錢柳莖段腋芽的離體培養(yǎng)技術(shù)[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2013，37(6)：6-10.

[9] FANG S Z，WANG J Y，WEI Z Y，et al.Methods to break seed dormancy inCyclocaryapaliurus(Batal)Iljinskaja[J].Scientia horticulturae，2006，110(3)：305-309.

[10] 謝寅峰，張志敏，尚旭嵐，等.青錢柳莖段腋芽萌發(fā)和叢生芽增殖[J].林業(yè)科學(xué)，2011，47(1)：50-55.

[11] 張志敏，張穎穎，謝寅峰，等.青錢柳愈傷組織誘導(dǎo)[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，39(9)：8-10.

[12] 沈海龍.植物組織培養(yǎng)[M].北京：中國林業(yè)出版社，2005.

[13] 上官新晨，郭春蘭，蔣艷，等.培養(yǎng)基和植物激素對(duì)青錢柳莖段和葉片愈傷組織誘導(dǎo)的研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，28(5)：678-682.

[14] 欒博宇，耿慧，王志峰，等.公農(nóng)1號(hào)紫花苜蓿離體培養(yǎng)中最佳消毒方式和外植體種類的篩選研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011(12)：35-37.

[15] 姚娜，賴志強(qiáng).象草腋芽外植體消毒方法的篩選[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010，29(5)：943-946.

[16] 韓佳宇，歐克緯，禤維言，等.石栗樹腋芽外植體消毒方法的篩選[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，43(8)：1169-1172.

Effects of Sampling Time and Disinfection Methods on Axillary Bud Induction ofCyclocaryapaliurus

WANG Ji1, YANG Jing2, YANG Wan-xia2, FANG Sheng-zuo2*

(1. Nanjing Xiaozhuang University, Nanjing, Jiangsu 211171; 2. Nanjing Forestry University, Nanjing, Jiangsu 210037)

[Objective] The aim was to solve the problem of explants pollution in tissue culture ofCyclocaryapaliurus. [Method] Axillary bud from stem segments ofCyclocaryapaliuruswere used as explants, and the effects sampling time and disinfection methods on axillary bud induction ofCyclocaryapaliuruswere studied. [Result] The best sampling time was April and May, 70% alcohol 30 s+0.10% mercuric chloride 12 min for April and 70% alcohol 30 s+0.05% mercuric chloride 16 min for May. [Conclusion] The results lay the basis for establishing asexual micropropagation system ofCyclocaryapaliurus.

Cyclocaryapaliurus; Sampling time; Disinfection methods; Axillary bud induction

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31270673)；南京曉莊學(xué)院青年專項(xiàng)(2015NXY76)。

王紀(jì)(1981- )，女，河南商水人，實(shí)驗(yàn)師，博士，從事植物組織培養(yǎng)研究。*通訊作者，教授，博士生導(dǎo)師，從事人工林培育研究。

2016-10-26

S 723.1

A

0517-6611(2016)34-0154-03