馬鈴薯松散型胚性愈傷組織的誘導

史滟滪++楊靜慧++劉婷++梁發輝++劉艷軍

摘 要：為了建立馬鈴薯松散型胚性愈傷組織體系，用于脫毒繁殖和誘變育種，試驗采用馬鈴薯塊莖為外植體，在含有不同濃度2，4-D，BA和MS的培養基上進行松軟型、松散型和胚性愈傷組織的誘導。結果顯示，在1/4 MS+1.0 mg·L-1 2，4-D+15 g·L-1蔗糖的培養基上可以誘導出松軟型馬鈴薯愈傷組織；在MS+0.5 mg·L-1 BA+0.25 mg·L-1 2，4-D+30 g·L-1蔗糖的培養基上，繼代3～5次，即可獲得松散型愈傷組織；在MS+1.0 mg·L-1 BA+1.0 mg·L-1 2，4-D+30 g·L-1蔗糖的培養基上，繼代5～8次，即可獲得松散型胚性愈傷組織。而且上述類型的愈傷組織生長迅速，結構特點突出。

關鍵詞：激素；培養基；繼代；脫毒培養

中圖分類號：S532 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.12.005

馬鈴薯是一種在我國具有高產量、高效益的適合廣大農作物地區耕作的糧食和經濟作物。近年來，我國廣大地區對馬鈴薯的栽培與育種方面的研究已取得了較多的突破，尤其是在馬鈴薯的組織培養方面取得了突出的成績[1-4]。馬鈴薯的脫毒培養已經被廣泛應用于馬鈴薯的種薯生產中，使用馬鈴薯脫毒種薯比沒脫毒的一般可增產30%～50%[5-10]。

目前，馬鈴薯脫毒培養主要依賴于莖尖脫毒技術，而采用松散型胚性愈傷組織進行組織脫毒的報道極少。用松散型胚性愈傷組織進行脫毒培養的方法可以獲得高效、優質的無毒材料。

本研究旨在采用這一脫毒新途徑建立馬鈴薯無毒苗培養體系，為生產上獲得優質無毒的馬鈴薯種源；本研究獲得的松散型胚性愈傷組織還可以用于體細胞誘變育種研究，可為馬鈴薯的育種拓寬途徑、奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究使用的馬鈴薯是購自天津市蔬菜市場的菜用馬鈴薯品種。

1.2 試驗方法

松軟型愈傷組織的培養方法：將馬鈴薯塊莖外植體接種到1/2，1/4 MS培養基中，其中分別加入0.25，0.5，1.0，2.0 mg·L-1的2，4-D，在接種10 d后在外植體傷口部位開始長出愈傷組織，經過大約40 d培養選擇生長迅速的、結構松軟的愈傷組織進行下一步培養。

松散型愈傷組織的培養方法：將所獲得的馬鈴薯松軟型愈傷組織，轉移到含有不同激素的松散型愈傷組織誘導培養基上，其中分別加入0.25，0.5，1.0，2.0 mg·L-1的生長素2，4-D和0.25，0.5，1.0，2.0 mg·L-1的細胞分裂素BA。經過3～5次繼代培養后（每10 d繼代一次），選擇結構松散的、生長迅速的愈傷組織進行下一步培養。

松散型胚性愈傷組織的培養方法：將上述獲得的松散型愈傷放入超凈臺中，再用解剖刀切成直徑3 mm的小塊，轉移到松散型胚性愈傷組織誘導培養基上。其中含有0.25，0.5，1.0，2.0 mg·L-1的生長素2，4-D和0.25，0.5，1.0，2.0 mg·L-1BA，或僅含有1.0，2.0 mg·L-1 BA及僅含有1.0 mg·L-1 2，4-D。經過5～8次繼代培養后（每20 d繼代一次），愈傷組織從外觀上出現了較大的變化，其中一些愈傷組織表面出現瘤狀顆粒，結構松散、質地緊密，在顯微鏡下可以看到愈傷組織細胞個體較小、細胞質濃度增大、細胞核較大，細胞處于旺盛的分裂狀態，即為松散型胚性愈傷組織。

以上處理均為每個處理6個重復，每處理放置8塊外植體，培養基均為MS培養基，添加7.0 g·L-1瓊脂粉和30 g·L-1蔗糖，pH值調到5.8。1/2 MS培養基為無機鹽采用1/2，蔗糖15 g·L-1，瓊脂粉7 g·L-1，pH值為5.8；1/4 MS培養基為無機鹽采用1/4，其余同1/2 MS的用量。

2 結果與分析

2.1 生長素和MS倍數對馬鈴薯塊莖松軟型愈傷組織形成的影響

通過不同濃度的生長素和MS總濃度的改變，比較愈傷組織的誘導率和生長速度以及質地的變化，結果如表1所示。從表1可以看出，所有處理都能誘導出愈傷組織，說明馬鈴薯是一種容易誘導產生愈傷組織的植物，但從愈傷組織生長及質地情況來看，不同培養基差異較大。其中，MS的倍數對愈傷組織質地影響較大，當用1/4 MS培養基培養時，愈傷組織為軟愈傷；而用1/2 MS培養基培養時，愈傷組織都為較硬的愈傷；不同2，4-D激素濃度也影響著愈傷組織的生長速度，在1/2 MS處理組中，增加2，4-D質量濃度0.25 ～2.0 mg·L-1時，愈傷組織生長速度會逐漸增加；但在1/4 MS處理組中，當其濃度超過1.0 mg·L-1時，愈傷組織生長速度出現下降。所以，在本試驗中，當2，4-D的濃度為1.0 mg·L-1時，培養的愈傷組織是松軟型愈傷組織，且生長速度較快。因此，馬鈴薯誘導松軟型愈傷組織的最佳培養基配方為：1/4 MS+1.0 mg·L-1 2，4-D+15 g·L-1蔗糖。

2.2 激素對馬鈴薯塊莖松散型愈傷組織形成的影響

通過不同濃度的BA和2，4-D激素組合，比較愈傷組織的質地、顏色和生長速度以及結構的變化，結果如表2所示。從表2可以看出，在不同處理中，誘導出的愈傷組織多數為緊密型，其中，采用較低的2，4-D濃度培養時（0.25 mg·L-1），隨著BA濃度的增加，愈傷組織的質地逐漸變硬，愈傷組織結構也從松軟變得松散，但進而變得緊密，說明BA使用濃度不宜過大，否則會導致愈傷組織致密、硬化；當BA濃度為0.5 mg·L-1時，愈傷組織基本為松散型愈傷。在BA濃度不變時，增加2，4-D的用量，愈傷組織結構基本為緊密型，雖然愈傷組織質地從軟變硬，但基本都是一些生長速度較快的細胞緊密結合在一起，造成愈傷組織團結構緊密。因此，適當選擇2，4-D的濃度是獲得松散型愈傷組織的關鍵。

本試驗還發現，隨著2，4-D濃度的增加，愈傷組織生長速度加快，雖然愈傷組織生長速度對于愈傷組織誘導有利，但過快則不能獲得理想的愈傷組織結構。綜上原因，對于誘導馬鈴薯松散型愈傷組織最理想的培養基為：MS+0.5 mg·L-1 BA+0.25 mg·L-1 2，4-D+30 g·L-1蔗糖。雖然培養基對于誘導馬鈴薯松散型愈傷組織十分必要，但繼代次數與繼代時間也很重要，在繼代轉移時將質地較硬的愈傷組織選擇下來也非常重要。

2.3 激素對馬鈴薯松散型胚性愈傷組織形成的影響

通過不同濃度的BA和2，4-D激素組合，比較愈傷組織的胚性、生長速度及其結構的變化，結果如表3所示。從表3可以看出，只加入BA或2，4-D激素時愈傷組織不能胚性化，單獨使用BA只能使得愈傷組織結構緊密，而單獨使用2，4-D只能使愈傷組織結構為松散型；當使用BA或2，4-D激素濃度為1.0 mg·L-1時，生長速度較快，而當激素濃度為2.0 mg·L-1時，生長速度有所下降。當加入一定濃度的BA和2，4-D激素組合時，愈傷組織部分或全部胚性化，愈傷組織結構松散型，生長速度隨激素濃度的增加而增加；但當2種激素組合的濃度達到2.0 mg·L-1時，愈傷組織結構變為緊密型，生長速度及胚性都有所降低。

3 討 論

2，4-D在愈傷組織誘導過程中起決定性作用，其在一定濃度范圍內，濃度的增加有利于胚性愈傷組織的誘導 [11-14]，但過高或過低的2， 4-D 濃度均不利于胚性愈傷組織的形成和分化再生 [15-18]。總的來看，誘導效果最好的是使用2，4-D或配合其他分裂素一起誘導，關于2，4-D的使用濃度主要根據植物的特性而定。另外，外植體的種類與生長勢、培養溫度、培養基的滲透壓以及附加其他生長素等都會影響2，4-D的使用濃度。

松散型愈傷組織在繼代培養時進行正確的選擇是很關鍵的。在進行愈傷組織誘導過程中，除了要考慮培養基成分與培養條件，對不同愈傷組織的取舍也非常關鍵。在誘導初期選擇較為堅硬的愈傷組織進行培養，然后對生長較快的愈傷組織進行繼續培養，還應及早篩除一些質地很硬但并不松散的愈傷組織，否則會影響對松散型愈傷組織的正確選擇。

影響愈傷組織胚性化的因素既有內因，也有外因。內因主要是遺傳問題，不能改變，而外因則是可以選擇的。因此，要想獲得愈傷組織的胚性化就必須找到適合的培養條件，在這些因素中，激素是很重要的影響因子，分裂素對愈傷組織胚性化作用較大。此外，培養溫度、營養、滲透壓、濕度等逆境條件也會對愈傷組織胚性產生一定的影響。總之，在進行愈傷組織胚性化誘導中，正確選擇培養條件是試驗成功的關鍵。

4 結 論

通過對馬鈴薯松散型胚性愈傷組織誘導過程中試驗，得到了一套完整的誘導方法：采用馬鈴薯塊莖為外植體，在1/4 MS+1.0 mg·L-1 2，4-D+15 g·L-1蔗糖的培養基上誘導出松軟型愈傷組織；移入MS+0.5 mg·L-1 BA+0.25 mg·L-1 2，4-D+30 g·L-1蔗糖的培養基上，繼代3～5次，獲得松散型愈傷組織；再移入MS+1.0 mg·L-1 BA+1.0 mg·L-1 2，4-D+30 g·L-1蔗糖的培養基上，繼代5～8次后，即可獲得馬鈴薯松散型胚性愈傷組織。

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