SSR分子標記鑒定青花菜雜交種‘津青一號’的純度

江漢民++文正華++劉莉莉++單曉政++孫德嶺

摘 要：以青花菜新品種‘津青一號及其親本為試驗材料，用SSR分子標記技術鑒定雜交種種子純度，從50對SSR引物中，篩選出了1對在雜交種和父、母本之間存在顯著差異的引物（L21），該引物擴增片段電泳條帶清晰可辨，且雜交種含有父、母本的特異互補帶型。利用該引物對108株‘津青一號雜交種進行純度鑒定，結果為96.30%，與大田形態鑒定結果98.15%相比，SSR標記與大田種植鑒定結果基本一致。這表明，引物L21可用于‘津青一號的純度鑒定。

關鍵詞：青花菜；SSR；種子純度鑒定

中圖分類號：S635.3 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.

Hybrid Purity Identification of Broccoli Variety ‘Jinqing No.1 Using SSR Method

JIANG Hanmin， WEN Zhenghua， LIU Lili， SHAN Xiaozheng， SUN Deling

（Key Laboratory of Vegetable Germplasm Resources Innovation，Tianjin Kernel Vegetable Research Institute，Tianjin 300384，China）

Abstract： In this paper， broccoli hybrids， 'Jinqing No.1' and its parents were used as plant materials，SSR molecular marker was used to analysis the polymorphism of these materials. Among the 50 pairs of SSR primers screened，one pair of primers（L21） had significant and legible differences between hybrid seeds and their parents. 108 individual seeds were tested with the primer， and the seed purity was 96.30%， which was closed to the result identified in the field of 98.15%.The results indicated SSR primer L21 could be used to detect the purity of 'Jinqing No.1'.

Key words： Broccoli； SSR； seed purity identification

青花菜（Brassica oleracea L.var.italica），又名西蘭花、青花椰菜等，屬于十字花科蕓薹屬1、2年生草本植物。青花菜以主莖及側枝頂端形成的綠色花球為食用部位，營養物質豐富，無論色澤、口感都備受青睞，深受廣大群眾所喜愛。

在青花菜的種植生產中，青花菜雜交種子的純度在很大程度上影響了品質和產量。在種子生產中，由于一些不可避免的因素混入自交產生的F1代種子或劣質種子及一些其他品種的雜交后代，從而導致生產出的種子純度不高。在種子市場上，不法商販銷售的假冒種子在很大程度上也降低了種子的質量。保證雜交種子的純度及優良品質，成為確保青花菜市場供應優質青花菜的一個重要前提。鑒定種子純度的傳統方法是大田形態學鑒定，該方法在鑒定周期和鑒定費用上有其局限性，且形態觀察的準確度難以保證。分子標記技術的出現使種子在分子水平上的鑒定成為可能。分子標記技術在種子鑒定方面的應用，節省了鑒定的時間和成本。SSR是DNA分子標記中的一種，是以PCR為基礎的技術，多態性高，成本較低，標記呈顯性和共顯性，操作較易實現，重復性較好[1]。有研究報道，利用SSR分子標記技術能準確鑒定青花菜種子的純合度[2]。此外，SSR分子標記也已經應用到其他經濟作物種子純度的鑒定，包括水稻、油菜、大豆、玉米等[3-10]。

本研究以津青一號及其父、母本為研究材料，利用SSR分子標記進行篩選，以期得到能產生特殊標記的引物，在檢驗該引物可靠后將其運用到雜交種子的鑒定中，供雜交種子在分子水平鑒定借鑒。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗材料為11DR-100（父本）、10FS-2（母本）、津青一號（F1代）。

1.2 SSR鑒定種子純度的評價

1.2.1 全基因組DNA提取 以改良CTAB法提取全基因組DNA，獲得的全基因組DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測純度并保存備用。

1.2.2 SSR引物 根據GenBank（http： / /www.ncbi.nlm.nih.gov /sites /entrez）網站上公布的青花菜EST序列設計合成SSR引物，選取長度大于100 bp的EST序列，共合成SSR引物50對。

1.2.3 標記篩選 以11DR-100、10FS-2及津青一號的全基因組DNA為模板，對50對SSR引物進行篩選，篩選出可在雜交F1代中擴增出與父母本互補帶型的引物。擴增程序為：94 ℃，5 min； 94 ℃，1 min；55 ℃，1 min；72 ℃，45 s；20 cycles；72 ℃，10 min。擴增產物用3%的瓊脂糖凝膠電泳進行篩選。

1.2.4 分子標記篩選的評價 在種有津青一號的試驗田內進行隨機抽樣，隨機選取12個區域，每個區域隨機選取9株，通過大田形態學方法對抽取的植株進行純度鑒定，并用已篩選到的SSR分子標記進行檢測，檢測得到的結果與試驗田種植結果進行比較，以評價所篩選出的分子標記的可用性。種子純度=（1-非雜交F1個體總數/鑒定的個體總數）×100%[11]。

1.3 種子純度的鑒定

隨機選取種子300粒進行鑒定。以種子長出的真葉為材料進行DNA提取，具體方法為：將濾紙浸濕后放入培養皿中，將種子放于濾紙上，于28 ℃培養箱中培養，培養過程中注意保濕，待長出真葉后用于全基因組DNA提取，方法同1.2.1。

2 結果與分析

2.1 全基因組DNA提取結果

11DR-100、10FS-2、‘津青一號的全基因組DNA提取結果如圖1。結果顯示，DNA主條帶較單一，沒有明顯的降解現象，表明本試驗用的改良CTAB提取法能獲得高質量的全基因組DNA，獲取的DNA可用于后續的SSR分子標記的篩選。

2.2 標記篩選結果

50對SSR引物擴增11DR-100、10FS-2、津青一號，對雙親及F1代進行特異分子標記分析，篩選可用的SSR標記。經PCR擴增后，有43對引物可擴增出有效條帶，并從中篩選出1對可用于鑒定的引物L21（F：5′-GGATTTTCAAGACTCTTCGGG-3′，R：5′-TGCCAAGTTCGTAGTCTTGC-3′）。該引物可在親本中擴增出單一互補的條帶，在雙親和F1代中共顯性分離，兩條特異條帶的大小為200，170 bp，結果見圖2。該引物可用來鑒定雜交種質資源的純度。

2.3 利用SSR鑒定青花菜雜交種純度的評價

在試驗田中，對隨機選取的108株青花菜的莖、花球、葉片進行調查分析和形態學鑒定。鑒定結果表明，108株青花菜中有2株青花菜的莖、葉片、花球與母本的表現型不一致，通過田間形態學鑒定的結果表明，‘津青一號種子純度為98.15%。對隨機選取的108株植株用已篩選出的SSR引物擴增進行鑒定分析。發現：其中有4株為混雜品種，經鑒定津青一號種子的純度為96.30%，引物擴增的部分結果見圖3。

2.4 對雜交種子的檢驗

利用篩選得到的SSR引物對隨機選取的300粒‘津青一號商品種子進行純度檢測，PCR擴增結果表明，引物在其中295粒中均表現出共顯性分離，有5粒為混雜種子，純度為98.33%，符合國家標準。

3 結論與討論

3.1 SSR引物

合成的50對引物是根據GenBank網站上公布的青花菜EST序列設計的，經過驗證發現，有43對SSR引物在青花菜中可擴增出有效條帶。SSR分子標記是以PCR技術為基礎的，條帶相對單一、穩定，操作簡單，成本較低。篩選出可用于鑒定雜交F1代的SSR分子標記，較形態學鑒定能有效減少鑒定的周期和成本，能快速準確地鑒定雜交F1代種子的純度。

3.2 SSR分子標記鑒定種子純度

雜交種子的純度在很大程度上影響了青花菜的品質和產量，在種子生產中由于一些不可避免的因素影響，造成了個別品種種子的混雜，使得種子的純度受到影響。種子鑒定的傳統方法即大田形態觀察法的周期長，形態區分的難度較大，易造成種子鑒定的準確度有偏差。分子標記的出現使得種子純度的鑒定周期縮短，穩定性提高，準確度得到保證。王立新等[12]利用SSR、EST-SSR和AFLP-SCAR對400個小麥品種進行鑒定研究，推薦了7對SSR引物、5對EST-SSR引物和3對AFLP-SCAR引物為檢測種子純度的核心引物；林琿等[13]應用RAPD標記對苦瓜種子進行純度鑒定，篩選出1個引物S115；王全等[14]利用SSR分子標記對黃瓜種子進行純度鑒定，篩選出1對可用的SSR引物。本研究以11DR-100、10FS-2、津青一號為材料，用50對SSR引物對其擴增。在有效的43對引物中，經過篩選得到1對在F1代中能產生與親本互補帶型的引物L21。在大田中隨機抽取108個津青一號樣品，對這些樣品分別進行大田形態學鑒定和SSR分子標記鑒定。對108株青花菜的莖、花球、葉片進行調查分析和形態學鑒定，結果表明津青一號種子純度為98.15%；利用篩選出的SSR引物L21對108個‘津青一號樣品進行鑒定分析，結果表明F1代‘津青一號種子的純度為96.30%：說明SSR分子標記篩選方法更能準確鑒別‘津青一號種子的純度。

在大田形態法鑒定的過程中，受局部生長環境不同、光照不均的影響，使青花菜不同品種間的形態差異不顯著，所以會造成一些不純品種未被鑒定出來；而SSR分子標記篩選能避免外界因素的影響，在DNA水平上對青花菜種子的純度進行評價，不但縮短了鑒定周期且提高了準確度。

利用SSR分子標記鑒定種子純度的方法也可應用于其他經濟作物，如甜瓜、水稻、小麥等[15-17]。分子標記的應用節省了種子鑒定的經費和時間，分子標記在種子鑒定方面有應用的價值。

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