P2X4Rs在腦缺血性損傷后小膠質細胞活化及炎癥反應中的作用

張艷艷 張筱英

P2X4Rs在腦缺血性損傷后小膠質細胞活化及炎癥反應中的作用

張艷艷 張筱英

P2X4受 體（P2X4 receptor，P2X4R，P2X4Rs） 是 ATP受體（P2-purinoceptors，P2）的一個亞型，廣泛分布在中樞神經系統，其中腦內主要分布于海馬、嗅球及大腦皮層等。研究發現腦缺血缺氧情況下，損傷后的神經元釋放ATP至胞外［1-2］，激活其配體門控性通道P2X受體［3-4］，進一步激活小膠質細胞，而過度活化的小膠質細胞可釋放一氧化氮合酶、促炎因子等物質介導炎癥反應進一步損傷神經元，而阻斷小膠質細胞的過度活化可減少炎癥因子的釋放，降低缺血導致的神經損傷［5-8］。因此抑制小膠質細胞的過度活化、調控小膠質細胞表面或細胞內表達的受體或蛋白分子、拮抗小膠質細胞產生的神經毒性因子、促進小膠質細胞分泌神經保護性物質、阻斷小膠質細胞介導的炎癥反應等成為腦缺血治療的新思路。本文對P2X4受體在腦缺血性損傷后小膠質細胞活化及其介導炎癥反應中的作用作一綜述。

1 腦缺血治療現狀

缺血性卒中是因腦的供血動脈阻塞導致其供血區血流量急劇下降而出現相應神經功能缺失的一類嚴重疾病。急性腦梗死病灶由中心壞死區及周圍的缺血半暗帶組成，缺血半暗帶內仍有大量可存活的神經元，損傷仍然可逆，保護這些可逆性損傷的神經元是治療急性腦缺血的關鍵。盡早恢復血流并積極采取腦保護治療是治療急性腦缺血的主要措施，但恢復血液再灌注具有嚴格時間窗限制（1～3h），患者常因各種原因錯過最佳的治療時機，一旦超過治療時間窗再恢復血流，不但不能減輕因缺血造成的神經元損傷，反而會因再灌注損傷造成更為嚴重的傷害，因此尋找有效的腦保護方法成為研究者關注的重點，探索新的腦保護途徑也顯得非常必要。但傳統的基礎研究大多將焦點集中在單純的神經元保護上，機制探討也均集中在神經元，而較少強調膠質細胞、內皮細胞等的作用。目前研究已經意識到這個問題，將注意力從單純以神經元為中心的神經保護策略轉化為更整合的觀點，即考慮到腦內所有細胞和基質在腦卒中的反應，并提出了神經血管單元的概念［9］。神經血管單元的理念強調通過調節細胞和細胞間的信號及細胞-基質的反應治療腦卒中損傷［10-12］。腦卒中既不是一個單純的神經疾病也不是一個單純的血管疾病，當其發生時，腦血流穩態和腦組織穩態被同時打亂，小膠質細胞被迅速激活，星形膠質細胞和少突膠質細胞受損等。理想的腦卒中治療的靶點應該是那些能發揮神經保護作用和減輕神經毒性作用并在多種腦細胞類型上均可產生作用的神經血管信號。

2 ATP受體與P2X4 受體

嘌呤能受體主要分為兩大類：腺苷受體（P1-purinoceptors，P1）和三磷酸腺苷（adenosine 5'-triphosphate disodium，ATP）受體（P2-purinoceptors，P2）。P1受體主要由腺苷激活，P2受體主要由ATP和ADP激活。P2受體又可分為P2X 和P2Y亞型。P2Y受體是G蛋白偶聯受體。P2X受體是配體ATP門控型離子通道。到目前已有7種 P2X受體亞型（P2X1-7）被成功克隆［13］。P2X4 受體廣泛分布于中樞神經系統，其中腦內主要分布于海馬、嗅球及大腦皮層等。在對不同的腦損傷模型的研究表明嘌呤類受體參與神經損傷及神經再生。腦缺血缺氧情況下，損傷后的神經元釋放ATP至胞外［1-2］，激活其配體門控性通道P2X受體［3-4］，進一步激活小膠質細胞，介導缺血導致的神經變性［14］。

3 P2X4受體活化小膠質細胞、介導炎癥反應機制

小膠質細胞是腦內重要的免疫細胞，廣泛分布于中樞神經系統，占腦細胞總數的12 %左右，占膠質細胞總數的5%～20 %，主要分布于灰質、白質纖維傳導束間神經元附近及血管旁。正常情況下，腦內的小膠質細胞處于靜息狀態，其胞體小，突起細長，呈分枝狀。靜息的小膠質細胞缺乏吞噬功能，但具有吞飲功能和一定的遷移能力，加之其在腦內廣泛而規律的分布，起到保持腦細胞數量的相對平衡和微環境液體凈化的作用，使凋亡的細胞和代謝產物及時清除，讓位于適合的細胞來構成功能系統的組成部分［15］，在這一重要機制的背景下，小膠質細胞保證腦內環境的相對穩定和可塑性，這對維持中樞神經系統的正常功能非常重要。小膠質細胞最顯著的特點之一是對外界環境刺激非常敏感。當中樞神經系統遭受損傷如腦缺血缺氧性損傷或微環境因子發生變化時，小膠質細胞便可迅速做出反應，形態上表現為從帶有分支的靜息狀態轉化為體積較大、胞體變圓并逐步成阿米巴樣激活狀態［16］。被激活的小膠質細胞發生增殖，釋放出腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），白細胞介素 -1 β（Interleukin-1β，IL-1 β）、白細胞介素 -6（IL-6）、自由基、超氧化物陰離子和一氧化氮等多種物質，引起各種不同程度的炎癥反應和神經元變性、壞死，從而間接調節和影響腦內其它細胞生長發育的生理過程，介導并加重腦組織的損害［17］。越來越多的證據也表明，炎癥在腦缺血損傷的發病機制、病理過程及臨床預后中發揮重要作用。蛋白、受體及細胞因子等多種因素參與小膠質細胞的活化調控過程及過度活化后所產生的繼發性損害。小膠質細胞活化調控過程的某些環節可能成為治療腦缺血藥物干預的靶點。因此，尋找抑制小膠質細胞過度活化的靶標在減輕腦卒中后腦組織損害的過程中顯得非常重要。

Moon 等［18］應用Fluoro-Jade B （F-JB） 染色法和離子鈣接頭蛋白1 （Ionized Calcium Binding Adaptor Molecule 1，Iba-1）免疫組織化學方法，分別考察短暫腦缺血損傷后沙鼠鋸齒狀腦回區神經元變性和小膠質細胞活化的時程改變。假手術組及缺血/再灌注組動物鋸齒狀腦回區均檢測到Iba-1免疫陽性（Iba-1+） 小膠質細胞，且小膠質細胞的形態多為分枝狀。腦缺血/再灌注后3h，小膠質細胞開始活化，Iba-1+小膠質細胞數量增多，小膠質細胞的體積增大。腦缺血/再灌注后6h，神經元開始變性。于腦缺血/再灌注后1d，神經元變性達高峰。腦缺血/再灌注后1～4d，Iba-1+小膠質細胞形態多為圓形或阿米巴狀，小膠質細胞活化于腦缺血/再灌注后2d達高峰。腦缺血/再灌注4d后，Iba-1+小膠質細胞數量減少，體積變小。腦缺血損傷最早期，小膠質細胞的活化可發揮一定的神經保護作用，但小膠質細胞過度活化后可產生一系列炎癥因子或介質介導神經元退行性變。腦缺血損傷可引起小膠質細胞的過度活化，而異常活化的小膠質細胞又參與到腦缺血的發病過程，并可引起繼發性腦損傷［19］。

WixeyJA等［20］研究表明在新生鼠腦缺血缺氧導致的炎癥反應中，P2X4R陽性表達的小膠質細胞發揮了重要作用。Cavaliere F等［21］研究表明缺血導致海馬損傷的過程與P2X4Rs有直接關聯。在對成年鼠脊髓損傷，腦外傷及腦缺血性損傷模型的研究中同樣發現P2X4R在腦缺血性損傷后廣泛表達［21-24］，并在小膠質細胞激活過程中起到一定作用。在小膠質細胞中大量表達的P2X4Rs的作用及其是否介導小膠質細胞的激活過程仍需進一步闡明。腦損傷后，損傷的神經元及膠質細胞釋放大量ATP［25］，細胞外ATP水平的升高導致P2X4Rs表達上調［26］。盡管ATP在胞外可被迅速降解為ADP及腺苷等，但聚集的ATP仍可通過作用于損傷后大量表達的P2X4Rs介導小膠質細胞的活化及其神經毒性作用。在中樞神經系統中活化的小膠質細胞參與一個完整的神經保護及神經毒性作用，這些過程通過ATP作用于P2X受體引發去極化及Ca2+內流得以實現。P2X4Rs主要表現為對Ca2+的高度通透，刺激表達于活化的小膠質細胞上的P2X4Rs可引發Ca2+內流，發生去極化［27-30］。聚集的ATP可激活小膠質細胞，而過度活化的小膠質細胞可釋放一氧化氮合酶、促炎因子等物質介導炎癥反應進一步損傷神經元，而阻斷小膠質細胞的過度活化可減少炎癥因子的釋放，降低缺血導致的神經損傷［5-8］。

研究表明腦缺血性損傷后P2X4受體介導小膠質細胞活化及炎癥反應，并進一步損傷神經元。P2X4受體拮抗劑有望阻止小膠質細胞過度活化所帶來的對周圍組織細胞的損害作用，從而保護腦組織不受進一步的損害。腦缺血時，抑制P2X4受體功能可能是腦缺血損傷治療的一個潛在性的藥物干預靶點。上述研究可能給腦缺血損傷治療帶來新的突破。

［1］ Braun N, Zhu Y, Krieglstein J, et al. Upregulation of the enzyme chain hydrolyzing extracellular ATP after transient forebrain ischemia in the rat. J Neurosci,1998,18(13)： 4891-4900.

［2］ Juranyi Z, Sperlagh B, Vizi ES. Involvement of P2 purinoceptors and the nitric oxide pathway in ［3H］purine outflow evoked by short-term hypoxia and hypoglycemia in rat hippocampal slices.Brain Res,1999,823(1-2)： 183-190.

［3］ Cavaliere F, Dinkel K, Reymann K. Microglia response and P2 receptor participation in oxygen/glucose deprivation-induced cortical damage. Neuroscience,2005,136(3)： 615-623.

［4］ Davalos D, Grutzendler J, Yang G, et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat Neurosci,2005, 8(6)： 752-758.

［5］ Ferrari D, Villalba M, Chiozzi P,et al.Mouse microglial cells express a plasma membrane pore gated by extracellular ATP. J Immunol,1996,156(4)： 1531-1539.

［6］ Shigemoto-Mogami Y, Koizumi S, Tsuda M, et al.Mechanisms underlying extracellular ATP-evoked interleukin-6 release in mouse microglial cell line, MG-5. J Neurochem,2001,78(6)：1339-1349.

［7］ Cai Z, Lin S, Fan LW, et al.Minocycline alleviates hypoxicischemic injury to developing oligodendrocytes in the neonatal rat brain. Neuroscience,2006, 137(2)： 425-435.

［8］ Fan LW, Lin S, Pang Y, et al. Minocycline attenuates hypoxiaischemia-induced neurological dysfunction and brain injury in the juvenile rat. Eur J Neurosci,2006,24(2)： 341-350.

［9］ Lo EH, Dalkara T, Moskowitz MA. Mechanisms, challenges and opportunities in stroke. Nat Rev Neurosci,2003,4(5)： 399-415.

［10］ Iadecola C. Neurovascular regulation in the normal brain and in Alzheimer's disease. Nat Rev Neurosci,2004,5(5)： 347-360.

［11］ Zlokovic BV. Neurovascular mechanisms of Alzheimer's neurodegeneration. Trends Neurosci,2005,28(4)： 202-208.

［12］ Abbott NJ, Ronnback L, Hansson E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci, 2006,7(1)： 41-53.

［13］ Burnstock G. Historical review： ATP as a neurotransmitter.Trends Pharmacol Sci,2006,27(3)： 166-176.

［14］ Le FRA, Brough D, Touzani O, et al.Role of P2X7 receptors in ischemic and excitotoxic brain injury in vivo. J Cereb Blood Flow Metab,2003,23(3)： 381-384.

［15］ Ward SA, Ransom PA, Booth PL,et al. Characterization of ramified microglia in tissue culture： pinocytosis and motility. J Neurosci Res,1991,29(1)： 13-28.

［16］ Streit WJ. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia,2002,40(2)： 133-139.

［17］ Gehrmann J, Banati RB, Wiessner C, et al.Reactive microglia in cerebral ischaemia： an early mediator of tissue damage.Neuropathol Appl Neurobiol,1995,21(4)： 277-289.

［18］ Moon JB, Lee CH, Park CW, et al. Neuronal degeneration and microglial activation in the ischemic dentate gyrus of the gerbil. J Vet Med Sci,2009,71(10)： 1381-1386.

［19］ Weinstein JR, Koerner IP, Moller T. Microglia in ischemic brain injury. Future Neurol,2010,5(2)： 227-246.

［20］ Wixey JA, Reinebrant HE, Carty ML, et al. Delayed P2X4R expression after hypoxia-ischemia is associated with microglia in the immature rat brain. J Neuroimmunol,2009,212(1-2)： 35-43.［21］ Cavaliere F, Florenzano F, Amadio S, et al. Up-regulation of P2X2, P2X4 receptor and ischemic cell death： prevention by P2 antagonists. Neuroscience,2003,120(1)： 85-98.

［22］ Guo LH, Schluesener HJ. Lesional accumulation of P2X(4)receptor(+) macrophages in rat CNS during experimental autoimmune encephalomyelitis. Neuroscience,2005,134(1)： 199-205.

［23］ Zhang Z, Artelt M, Burnet M, et al. Lesional accumulation of P2X4 receptor+ monocytes following experimental traumatic brain injury. Exp Neurol,2006,197(1)： 252-257.

［24］ Kim DS, Kwak SE, Kim JE, et al. The co-treatments of vigabatrin and P2X receptor antagonists protect ischemic neuronal cell death in the gerbil hippocampus. Brain Res,2006,1120(1)： 151-160.

［25］ Ahmed SM, Rzigalinski BA, Willoughby KA,et al.Stretch-induced injury alters mitochondrial membrane potential and cellular ATP in cultured astrocytes and neurons. J Neurochem,2000,74(5)：1951-1960.

［26］ Inoue K. The function of microglia through purinergic receptors：neuropathic pain and cytokine release. Pharmacol Ther, 2006,109(1-2)： 210-226.

［27］ Burnstock G. Purine and pyrimidine receptors. Cell Mol Life Sci,2007,64(12)： 1471-1483.

［28］ Egan TM, Khakh BS. Contribution of calcium ions to P2X channel responses. J Neurosci,2004,24(13)： 3413-3420.

［29］ Qureshi OS, Paramasivam A, Yu JC, et al.Regulation of P2X4 receptors by lysosomal targeting, glycan protection and exocytosis.J Cell Sci,2007,120(Pt 21)： 3838-3849.

［30］ Illes P, Norenberg W, Gebicke-Haerter PJ. Molecular mechanisms of microglial activation B. Voltage- and purinoceptor-operated channels in microglia. Neurochem Int,1996,29(1)： 13-24.

浙江省教育廳立項課題（Y201430731）

310003 浙江大學醫學院附屬第一醫院