細胞凋亡在激素性股骨頭壞死發病中作用機制的研究進展

黃立佳 孫成龍 黃楊 鄒陽 王昌興?

細胞凋亡在激素性股骨頭壞死發病中作用機制的研究進展

黃立佳 孫成龍 黃楊 鄒陽 王昌興?

目前，臨床上較多免疫性疾病均不能根治，使用類固醇激素延緩病情已成為一種有效手段，但長期使用激素所帶來的副作用卻不容忽視，如腎上腺皮質功能損害、骨質疏松和自發性骨折等。激素性股骨頭缺血性壞死（Steroid-induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH）可能由長期使用糖皮質激素引起，最新的流行病學調查顯示，SANFH占所有骨壞死病例的24.1%［1］。研究表明在激素性股骨頭壞死中存在成骨細胞、骨細胞、軟骨細胞凋亡［2］，這表明骨細胞凋亡是SANFH病程發展中的細胞學基礎。本文對目前SANFH中骨細胞凋亡的相關基因及細胞因子研究成果作一綜述。

1 激素性股骨頭壞死中骨細胞凋亡相關基因

1.1 Bcl-2家族 在Bcl-2家族中，Mcl-1、Bcl-w、Bcl-xL及Bcl-2具有抗凋亡及細胞保護的作用，其機制為［3］：（1）鈣離子在細胞凋亡中起到重要作用，而通過實驗發現高表達Bcl-2 可以抑制內質網釋放鈣離子，故可以起到抗凋亡的作用。（2）Bcl-2可以通過抑制自由基的產生從而抗凋亡。（3）Bcl-2在線粒體膜上定位固定凋亡蛋白前體（Apaf-1），從而使Apaf-1不能激活凋亡信號。而大劑量的激素抑制Bcl-2的表達，使凋亡信號激活且不受抑制。

相關研究表明，作為抑制和促進凋亡的Bcl家族的兩種典型蛋白質，Bcl-2和Bax在調節線粒體膜通透性，線粒體功能和細胞色素C（Cyt-c）釋放的作用中起關鍵作用，Bcl-2和Bcl-xL可以抑制線粒體通透性轉換孔（PTP）開放，而避免因Bax導致PTP開放所引起的外基質內流，線粒體腫脹破壞從而細胞凋亡，Bcl-2可以阻斷線粒體釋放Cyt-c，細胞是否對凋亡信號發生反應較大程度上取決于Bax / Bcl-2的比值，當Bax / Bcl-2比值大于正常時，細胞易發生凋亡，當比值小于正常時，凋亡則被抑制，然而大劑量的激素抑制了Bcl-2的表達，使細胞易凋亡［4］。Zhang等［5］研究發現在激素性股骨頭壞死細胞凋亡中，通過抑制 Bcl-2的減少和Bax的增加，抑制骨細胞的凋亡和股骨頭壞死的惡化。有研究報道，隨著SANFH病程的發展，Bcl-2的表達水平逐漸下降［6］。1.2 Fas/FasL 系統 Fas/FasL系統是細胞凋亡的主要途徑之一，Fas（也稱為CD95或APO-1或TNFRSF6）是 I 型跨膜糖蛋白，在其細胞質區域含有死亡結構域（DD），這對于凋亡的誘導是必需的。Fas 的配體 FasL，為Ⅱ型跨膜糖蛋白，主要在活化 T 細胞膜上表達。Fas 和FasL屬于TNF家族成員，凋亡的誘導由Fas與其配體FasL的相互作用觸發，FasL是允許銜接蛋白Fas相關死亡結構域（FADD）募集和procaspase-8結合的 40kDa膜蛋白［7］，Fas 和 FasL結合形成一種活性形式三聚體，傳遞凋亡信息，誘導凋亡進行［8］。Thaler等［9］報道稱，使用蘿卜硫烷上調小鼠骨細胞內Fas的表達，并誘導前成骨細胞的凋亡。Martin 等［10］通過研究發現 MLO-Y4 骨細胞用地塞米松處理后出現 FasmRNA 表達增加，并導致骨細胞凋亡。

1.3 p53基因 P53與細胞凋亡密切相關，p53通過控制增殖細胞由細胞周期G1向S移行的控制點參與細胞周期調控。其具有強迫DNA損傷的細胞停滯在G1期并進行DNA修復。如DNA不能被修復，則誘導其凋亡。p53已被證明能導致線粒體功能障礙，且能通過多種信號通路激活caspase家族，誘導細胞的凋亡［11］。Ou等［12］研究發現FAK-P53-MDM2信號回路在腫瘤細胞增殖和凋亡中起重要作用，FAK和MDM2是腫瘤基因，FAK是p53的負調節物，通過敲除FAK和MDM2基因，p53基因得到活化，促進了腫瘤細胞凋亡及抗增殖效應。Okuma等［13］在缺血/再灌注誘導的特發性骨壞死模型中，觀察到p53的過表達誘導MLO-A5前成骨細胞的凋亡，且利用p53抑制劑改善這種情況。Sui等［14］在大劑量糖皮質激素誘導的骨質疏松模型中應用流式細胞儀檢測到與對照組比較BMSC凋亡增加，且p53表達增加。

1.4 Caspase家族 有研究表明Caspase與真核細胞的凋亡密切相關，目前已經發現總共14個家族成員，且可以分為兩類：一個涉及其他Caspase家族成員的激活，包括Caspase- 1，2，4，5，8，9和10；另一種是主要介導凋亡的執行期，包括Caspase-3，6，7，14。其中Caspase-3是Caspase家族中發揮作用的主要形式，是凋亡級聯反應的中心環節，是關鍵酶和凋亡的執行者［15］。凋亡由線粒體外膜的完整性喪失，細胞凋亡蛋白如Cyt-C的釋放，然后激活Caspase-3，通過Fas / FasL或Bax / Bcl-2途徑誘導的細胞凋亡［16］。賈巖波等［17］發現在激素性股骨頭壞死早期細胞凋亡中，Caspase-3表達顯著增高，且可通過藥物抑制Caspase-3的表達而減少骨細胞的凋亡。這表明Caspase-3與激素性股骨頭壞死早期細胞凋亡密切相關。Xu等［18］2014年報道在激素性股骨頭壞死中，STAT1-Caspase-3通路在激素性股骨頭壞死中起到重要作用，Caspase-3的上調是導致細胞凋亡的主要因素。

1.5 血紅素氧合酶-1 近期研究表明，血紅素氧合酶-1（heme oxygenases HO-1）具有抗氧化、抗凋亡及在缺血缺氧情況下保護細胞的功能［19］。作為細胞保護酶，HO-1催化血紅素降解中的限速步驟，并產生三種最終副產物，包括膽紅素、CO及鐵離子。膽紅素是由膽綠素和膽綠素還原酶反應產生，是消除脂質過氧化物有效的自由基清除劑，CO可以減弱一些氧合酶的催化活性，并抑制過量的NO產生［20］。李杰等［21］利用質粒將HO-1轉染進入成骨細胞中，乙醇干預24h后流式細胞儀檢測細胞凋亡，結果顯示HO-1轉染組細胞凋亡率明顯減低，這表明轉染HO-1能抑制乙醇誘導的細胞凋亡。Sato等［22］發現在缺血性股骨頭壞死疾病進展中存在細胞凋亡，且與HO-1mRNA表達有存在相關性，在創傷后3h在成骨細胞和骨細胞中檢出凋亡相關基因HO-1mRNA的表達，在6h時出現組織學改變，表現為骨骺處活躍成骨細胞的死亡，TUNEL染色陽性細胞表達，24h時在骨細胞和骨髓細胞中觀察到凋亡小體，在3～24h內HO-1mRNA持續表達，在24h后HO-1mRNA表達逐漸減少或消失。但目前國內外尚未報道HO-1是否參與激素性股骨頭壞死細胞凋亡進程，有待后續研究。

2 激素性股骨頭壞死中骨細胞凋亡相關細胞因子

2.1 低氧誘導因子1α 低氧誘導因子1α（hypoxia －inducible factor-1 alpha，HIF-1α）在細胞缺血缺氧時產生保護作用，在正常氧含量情況下，HIF-1α活性受到氧依賴性羥化酶－缺氧誘導因子抑制因子（factor inhibiting HIF，FIH）及脯氨酰羥化酶（prolyl－hydroxy-lases，PHDs）的一系列調控，從而羥基化被抑制，細胞缺氧時，FIH和PHDs的活性受到抑制，HIF-1α的活性增高，缺氧時可誘導HIF -1α進入細胞核，與HIF - 1β結合形成HIF - 1，提高共激活因子CBP/ P300，反式激活下游靶基因，包括纖溶酶原激活物抑制劑1型，血管內皮細胞生長因子及fm-樣酪氨酸激酶1等，導致細胞一系列功能改變，如血管發生，能量代謝等，使其對缺氧環境產生耐受［23］。He等［24］報道HIF - 1α在缺氧時可通過多種信號通路來實現對細胞在低氧狀態下的保護。

缺血缺氧是激素性股骨頭壞死發病的關鍵因素，趙振群等［25］研究發現HIF-1α在激素性股骨頭缺血壞死早期呈現低表達，且與骨細胞凋亡率呈負相關。Fan等［26］在激素性股骨頭壞死動物模型中使用PHDs抑制劑EDHB抑了HIF-1α的降解，激活HIF-1信號通路促進血管生成，降低空骨陷窩率，減少細胞凋亡。至今，對于激素如何抑制HIF-1α的表達國內外尚未報道，未來可作進一步的研究。

2.2 血管內皮生長因子 血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種同源二聚體糖蛋白，活化的VEGF能促進新血管的生成，紅細胞生成及細胞的增殖和生存，而VEGF-165不僅在VEGF家族中活性最高，且分布范圍之廣，是發揮作用的主要形式，有研究通過建立急性放射性皮膚損傷模型，分組給予不同血管生長因子，通過觀察微循環和細胞凋亡的變化比較發現VEGF-165在抑制細胞凋亡和預防損傷進展上比其他因子更有效［27］。研究發現，VEGF參與缺血性股骨頭壞死的病理生理過程，Zhang等［28］將6周齡Sprague Dawley大鼠股骨頸周圍血管切除制造缺血性股骨頭壞死模型，通過實時RT-PCR研究分析軟骨細胞中VEGF的表達，結果顯示，在24h內，常氧條件下軟骨細胞中的VEGF水平顯著高于缺氧條件下的含量；72h后，缺氧條件下的軟骨細胞中的VEGF水平增加并且顯著高于常氧條件下的含量。Wu等［29］應用桃紅四物湯促進激素性股骨頭壞死模型體內VEGF的表達，并且明顯抑制了成骨細胞和軟骨細胞的凋亡。Hang等［30］應用脂質體將VEGF-165導入骨髓間充質干細胞中，將自體VEGF-165轉基因骨髓間充質干細胞植入早期股骨頭壞死模型，12周后觀察到轉基因組的骨小梁的規則布置和明顯的骨再生，且新生毛細血管數量與非轉基因自體骨髓間充質干細胞植入組比較明顯增加，證明VEGF-165能改善早期股骨頭壞死模型中的骨重建和血管再生，為治療早期股骨頭壞死提供一種好方法。

3 討論

類固醇激素誘發的股骨頭無血管性壞死主要好發于年輕人和老年人，患者一般曾長期或短期密集使用激素，在多數患者中，該疾病是雙側的，且病變面積很廣、致殘率高。目前，激素性股骨頭壞死主要通過手術來治療，包括：髓芯減壓術、植骨術、股骨近端截骨術及人工股骨頭置換術。

細胞凋亡是激素性股骨頭壞死的重要病因之一，激素在病程進展中，誘導了成骨細胞和骨細胞的凋亡，減少破骨細胞的形成，導致骨轉換的減少，促進連續凋亡。目前通過干預相關重要基因及細胞因子從而減少骨細胞凋亡率已成為研究的熱點，但對于激素如何上調或下調凋亡基因及細胞因子還需做進一步的探究，明確激素誘導細胞凋亡的機制，從而可選擇激素致病的最初靶點進行干預，從源頭降低應用激素治療相關疾病時股骨頭壞死的風險，最大程度的保證激素的療效。

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310053浙江中醫藥大學第二臨床醫學院（黃立佳 孫成龍 黃楊）

310005 浙江中醫藥大學附屬第二醫院（鄒陽 王昌興）

*通信作者