健康成年人唾液中胃蛋白酶含量測定在輔助檢測咽喉反流中的應用研究

李進讓 田師宇 鄒世楨 劉濤 于磊 王文軍

·論著·

健康成年人唾液中胃蛋白酶含量測定在輔助檢測咽喉反流中的應用研究

李進讓1田師宇1鄒世楨1劉濤2于磊2王文軍3

目的初步探索健康成年人唾液中胃蛋白酶含量范圍，為臨床檢測、診斷咽喉反流性疾病提供參考依據(jù)。方法2016年9月1日～9月30日在海軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科門診招募50名健康成年人作為受試者，收取受試者晨起空腹情況下黏白唾液，封存于1.5 ml無菌EP管內(nèi)，并在30min內(nèi)將EP管放置于-28℃冰箱中冷凍，最長冷凍時間不超過2周；采用人胃蛋白酶ELISA檢測試劑盒測定受試者唾液中胃蛋白酶含量。結果50名健康受試者晨起痰液中胃蛋白酶含量為（24.22 ±6.94）ng/ml，95%CI為（22.18，26.06）ng/ml。 其中，男性受試者唾液中胃蛋白酶含量為（22.78 ±1.35）ng/ml，95%CI為（20.00，25.57）ng/ml；女性受試者唾液中胃蛋白酶含量為（25.67 ±1.39）ng/ml，95%CI為（22.80，28.54）ng/m l。結論健康成年人唾液中存在一定含量的胃蛋白酶，檢測唾液胃蛋白酶含量有望用于咽喉反流性疾病的診斷。

胃；蛋白酶； 咽喉； 參考值

臨床中以咽部異物感、慢性咳嗽、頻繁清嗓、發(fā)音異常、吞咽不適等主訴就診的患者在耳鼻喉科門診就診患者中占50%以上，常診斷為慢性咽喉炎（Chronic pharyngitis），且常規(guī)咽炎藥物治療效果欠佳[1]。隨著現(xiàn)代醫(yī)療水平的發(fā)展，診療技術的不斷完善，咽喉反流（laryngopharyngeal reflux，LPR）逐步被人們所認知，其主因是食管上下括約肌功能障礙導致的胃內(nèi)容物反流至食管上括約肌以上部位引起咽喉部粘膜的損傷，從而出現(xiàn)聲音嘶啞、頻繁清嗓、咽喉部異物感等癥狀。國內(nèi)外已有眾多相關臨床研究發(fā)現(xiàn)咽喉反流的發(fā)病率為3.86%～34.39%，甚至更高[2-4]。在咽部異感癥、發(fā)音障礙、睡眠呼吸功能障礙等患者中存在咽喉反流相關問題，咽喉反流也是任克間隙水腫、喉狹窄、喉接觸性肉芽腫、喉癌等多種疾病的致病因素之一。對于此類患者，目前國內(nèi)多采用診斷性治療，即對疑似咽喉反流的患者給予一段時間的規(guī)律抑制胃酸治療，通過驗證其是否有效，以判斷咽喉反流的存在，此法在對疾病診斷的同時又起到治療作用，但不足之處在于其療效帶有較大的主觀性，缺乏判斷療效的客觀指標，確診耗時相對較長等。目前對于咽喉反流的客觀診斷主要是24h多通道腔內(nèi)阻抗-雙探針pH值監(jiān)測，但該方法為有創(chuàng)檢查，且必須在醫(yī)院進行監(jiān)測，同時此法在國內(nèi)耳鼻咽喉頭頸外科并不普及，同時尚沒有達成統(tǒng)一的診斷標準，這也給咽喉反流相關疾病患者在臨床診療方面增加了不確定性[5]，故迫切需要一種行之有效，簡單便捷的方法對其進行診斷，目前國際上研究熱點主要是對唾液胃蛋白酶的研究[6-8]，其旨在通過唾液胃蛋白酶檢測，為證實咽喉反流的存在提供客觀依據(jù)，并得到了相關學者的認可。但目前該方法僅停留在臨床研究階段，并未投入臨床實際當中[6，7]，同時目前國內(nèi)對于健康成年人唾液中胃蛋白酶含量值鮮有報道，故本研究通過檢測健康成年人群中唾液胃蛋白酶含量以為臨床診斷咽喉反流性疾病奠定基礎。

資料與方法

一、一般資料

招募健康受試者50名，男女各半，25名男性受試者中，年齡（29.36±6.82）歲，RSI 0～7分，中位數(shù)3分；25名女性受試者中，年齡（28.04±6.40）歲，RSI 0～8分，中位數(shù)1分。受試者納入標準：年齡18～80周歲；知情同意及自愿參與本研究；配合填寫反流癥狀指數(shù)量表（RSI），且評分＜13分者。排除標準：目前或兩周內(nèi)患有口腔、咽喉、食管及胃部疾病的對象；RSI表評分＞13分者。

二、方法

1.唾液收取方法

囑受試者前一天晚餐以清淡飲食為主，零點以后禁食禁水，由項目研究者本人逐一收取受試者第二天晨起6∶00～8∶00空腹情況下黏白唾液，封存于1.5 ml無菌EP管內(nèi)，并在30 min內(nèi)將EP管放置于-28℃冰箱中冷凍，最長冷凍時間不超過2周，以保證胃蛋白酶的穩(wěn)定性和檢測的準確性。

2.實驗材料

受試者唾液；酶標儀（SpectraMax M3多功能酶標儀，Molecular Devices，美國）；恒溫培養(yǎng)箱（SHZ-82A氣浴恒溫振蕩器，浙江金壇科析儀器有限公司生產(chǎn)）；高精度移液器（Eppendorf，德國）；人胃蛋白酶 ELISA試劑盒（Human Pepsin ELISA Kit，YX-160516H，R&D Systems Inc，USA），試劑盒內(nèi)包括所需的微孔酶標板、標準品、樣本稀釋液、檢測抗體-HRP、洗滌緩沖液、底物 A、底物 B、終止液封板膜等。

3.實驗方法：實驗操作步驟如下：

①從室溫平衡20 min后的鋁箔袋中取出5條微孔酶標板；

②設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；

③樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；

④每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃恒溫箱溫育60 min；

⑤棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此反復洗板5次；

⑥每孔加入底物A、B各50 uL，37℃避光孵育15 min；

⑦每孔加入終止液50μL，15 min內(nèi)，在450 nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），計算樣品濃度。

結 果

本項研究招募的50名健康受試者痰液中胃蛋白酶含量為（24.22 ±6.941）ng/m l，95%CI為（22.18，26.06）ng/ml。 其中，男性受試者唾液中胃蛋白酶含量為（22.78 ±1.35）ng/ml，95%CI為（20.00，25.57）ng/ml；女性受試者唾液中胃蛋白酶含量為（25.67 ±1.39）ng/ml，95%CI為（22.80，28.54）ng/ml。

討 論

咽喉反流性疾病（laryngopharyngeal Refulx Disease，LPRD）是指胃內(nèi)容物（胃酸、胃蛋白酶、胰酶、膽汁酸等物質(zhì)）反流進入咽喉部直接接觸咽喉黏膜，并對其具有侵蝕作用而引起咽喉部各種癥狀的一種疾病。患者常常以咽部異物感、慢性咳嗽、頻繁清嗓、發(fā)音疲勞等就診，該病具有診斷價值的臨床體征主要包括：聲帶彌漫性充血水腫、喉室消失、后聯(lián)合區(qū)域黏膜增生、紅斑或充血、肉芽腫等[9]。研究發(fā)現(xiàn)引起咽喉部黏膜損傷的機制可能為：胃蛋白酶及胃酸等物質(zhì)反流刺激咽喉部黏膜，可以引起機體內(nèi)鱗狀上皮蛋白、熱休克蛋白及E-鈣粘蛋白等發(fā)生變化，從而對黏膜組織造成損傷；胃內(nèi)容物反流可以刺激遠端食管，引起迷走神經(jīng)反射，從而出現(xiàn)慢性咳嗽和頻繁清嗓等癥狀[10]。可見在黏膜組織的損傷過程中，胃蛋白酶起到非常重要的作用，這也是當前研究的熱點問題。

由于咽喉反流癥狀不典型、且缺乏臨床特異性，臨床醫(yī)生往往易診斷為“慢性咽喉炎”或“咽異感癥”。有國外學者曾報道在嗓音疾病患者中，50%的pH監(jiān)測記錄到咽喉反流現(xiàn)象[1]。24 h腔內(nèi)阻抗雙探針pH監(jiān)測被認為是診斷咽喉反流的“金標準”，但是近年來隨著研究的不斷開展及深入，已有越來越多的學者對其在咽喉反流診斷中的價值提出質(zhì)疑，因為該檢查存在諸多不足：①監(jiān)測探針定位對操作者技術水平要求較高，置入位置目前尚無統(tǒng)一標準；②置入探針易出現(xiàn)移位、甚至脫落，從而出現(xiàn)假陰性結果或?qū)е卤O(jiān)測失敗；③該檢查屬于有創(chuàng)操作，部分患者不能耐受，且監(jiān)測結果易受到進食和活動影響。因此尋找一種高效、無創(chuàng)、客觀的診斷方法準確地診斷咽喉反流性疾病，更符合臨床一線工作者的需要[11]。

胃蛋白酶只有胃壁主細胞分泌，因此一般認為，在上氣道分泌物中檢測到胃蛋白酶的存在表明有咽喉反流的存在。Knight等[6]對23例患者的63份痰液標本應用免疫方法進行胃蛋白酶檢測，并與pH監(jiān)測結果進行分析發(fā)現(xiàn)，pH監(jiān)測到咽喉反流后的痰液標本14份，其胃蛋白酶含量的中位數(shù)是0.18（0.003～22）mg/mL，pH監(jiān)測沒有反流的49份痰液標本中沒有檢測到胃蛋白酶。與pH監(jiān)測結果對比，根據(jù)胃蛋白酶檢測結果判斷咽喉反流的靈敏度是100%，特異度是89%。作者認為，痰液胃蛋白酶檢測有可能成為診斷咽喉反流的方法，但是由于其需要pH監(jiān)測發(fā)現(xiàn)咽喉反流之后取得的痰液標本才能檢測的到胃蛋白酶，認為根據(jù)反流情況取痰液進行檢測離臨床實際應用有較大差距。之后大量研究發(fā)現(xiàn)，有咽喉反流癥狀患者的唾液或痰中的胃蛋白酶的含量高于對照組，而且可以作為判定治療效果的客觀指標[12]，但是有研究認為唾液中的胃蛋白酶陽性與否與咽喉反流癥狀無相關性，作為診斷胃食管反流食管外癥狀的方法敏感性較差[13]，也有研究在有咽喉反流癥狀的患者和對照組的唾液中均未檢測到胃蛋白酶[14]。

Ocak等研究認為增加檢測痰液標本收集次數(shù)有可能提高診斷的敏感性[15]。Fortunato等[16]對90例阻抗-pH監(jiān)測證實的咽喉反流患者和無癥狀的43例對照組的唾液胃蛋白酶進行檢測，每例患者進行24 h阻抗-pH監(jiān)測時取不同時間段的痰液，共8份（置入pH監(jiān)測導管前、三餐前和三餐后半小時以及晨起醒后），而對照組僅取一次的痰液。85.6%（77/90）的患者組患者至少有一次的唾液胃蛋白酶陽性，而對照組僅為9.3%（4/43），24 h不同時間的胃蛋白酶含量差異很大，反流后2 h內(nèi)唾液胃蛋白酶含量為（30.7±13.5） ng/mL，2 h后降為（16.5±39.1）ng/mL，說明唾液胃蛋白酶陽性率與癥狀和pH監(jiān)測結果相關。Na SY等[7]通過對57例咽喉反流患者晨起空腹狀態(tài)下、三餐后1 h唾液中胃蛋白酶含量測定，發(fā)現(xiàn)晨起空腹狀態(tài)下胃蛋白含量最高，認為晨起空腹狀態(tài)下的唾液胃蛋白酶檢測可以作為診斷咽喉反流的方法。由于24 h唾液胃蛋白酶含量值差異較大，唾液胃蛋白酶濃度不能作為判定反流嚴重程度的準確指標，故取何時的唾液檢測胃蛋白酶以作為判定咽喉反流的指標值得進一步研究。

因正常人可以有一定的咽喉反流，故在正常人群唾液中可以檢測到微量胃蛋白酶，若口腔唾液中檢測到較大量的胃蛋白酶，則表明有較嚴重的咽喉反流的存在，因此唾液胃蛋白酶檢測有望成為診斷咽喉反流的一種敏感、無創(chuàng)的方法。但是各國的研究對唾液中胃蛋白酶的正常值并不統(tǒng)一，國內(nèi)也缺乏相關研究，本實驗根據(jù)Na SY等[7]的研究結果，取晨起空腹狀態(tài)下的痰液，采用ELISA實驗法進行胃蛋白酶檢測，發(fā)現(xiàn)50名健康受試者痰液中胃蛋白酶含量為（24.22 ±6.94）ng/ml，95%CI為（22.18，26.06）ng/ml，這一結果表明正常成年人晨起空腹狀態(tài)下的唾液中存在一定含量的胃蛋白酶。

本研究樣本量有限，建議以后進一步擴大樣本量，并開展多中心研究，制定國人健康人群唾液中胃蛋白酶含量的檢測結果標準，以期為臨床診斷咽喉反流提供參考依據(jù)。

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Pepsin measurem ent in saliva of the healthy adults for detection of laryngopharygeal reflux

Li Jinrang1，Tian Shiyu1，Zou Shizhen1，Liu Tao2，Yu Lei2，Wang Wenjun3.

1Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery，Navy General Hospital，Beijing，100048，China.2Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery，The Second Affiliated Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang， Hebei，050000，China.3Beijing Qiji Biotechnology Co.Ltd，Beijing 100084，China

Li Jinrang，Email：entljr@sina.com

ObjectiveTomeasure the pepsin level in saliva of the healthy adults in order to find a method to diagnose the laryngopharyngeal reflux disease by measurement of the pepsin level in the saliva of patients.M ethodsFrom Sept.1 2016 to Sept.30，2016 in Department of Otolaryngology Head Neck Surgery，Navy General Hospital，50 healthy adults were random ly recruited as subjects，and the saliva was collected into 1.5ml sterile EP tubes after awaking in themorning，and the tubeswere placed in a refrigerator of-28 ℃ within half an hour，meanwhile the longest freezing timewas less than 2 weeks.The level of pepsin in saliva wasmeasured by human pepsin ELISA kit.ResultsAmong the 50 subjects，the average content of pepsin in saliva was（24.22 ±6.94）ng/m l and the 95%confidence interval was（22.18，26.06）ng/ml.The average content of pepsin in saliva was（22.78 ±1.35）ng/ml and 95%confidence interval was 20.00，25.57）ng/ml inmale group.The average content of pepsin in saliva was（25.67 ±1.39）ng/ml and 95%confidence interval was（22.80，28.54）ng/ml in female group.ConclusionThe pepsin can be detected in the saliva of the healthy adults，the level of the pepsin in the saliva of the patients may be used to the diagnosis of the laryngopharyngeal reflux disease in the future.

Stomach； Pepsin； Laryngopharyngeal； Reference value

10.3877/cma.j.issn.1674-6899.2017.01.00

首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項基金資助（2016-2-5111）

100048 北京，海軍總醫(yī)院全軍耳鼻咽喉頭頸外科中心1；050000 石家莊，河北醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科2；100084 北京，北京騏驥生物技術有限公司3

李進讓，Email：entljr@sina.com

2016-12-26）

（本文編輯：王儉）