淺談神經系統遺傳性疾病基因診斷策略及問題

李洵樺 陳定邦 吳超

.專題綜述.

淺談神經系統遺傳性疾病基因診斷策略及問題

李洵樺 陳定邦 吳超

神經系統遺傳性疾病臨床癥狀復雜、診斷困難,基因檢測是明確診斷的終極手段.近年來分子診斷技術的進步、方法的更新,尤其是二代基因測序技術的廣泛應用,使從眾多檢測方法中選擇適宜的基因檢測方法成為臨床醫師的新挑戰.本文擬從疾病臨床表型出發,結合不同基因突變和基因檢測方法,對神經系統單基因遺傳病基因診斷策略及問題進行綜述.

遺傳性疾病,先天性; 神經系統疾病; 基因; 綜述

迄今已經確定的單基因遺傳病近5000種,其中大多數累及神經系統,導致神經系統遺傳性疾病.神經系統遺傳性疾病種類繁多且罕見,臨床癥狀復雜,具有高度遺傳異質性和臨床異質性,且各種疾病之間癥狀常重疊,故臨床診斷困難,基因檢測是明確診斷的終極手段.近年來,分子診斷技術的不斷進步,尤其是二代基因測序(NGS)技術的廣泛應用,使基因檢測成本降低、時間減少,然而如何從眾多方法中選擇適宜的基因檢測方法成為臨床醫師面臨的新挑戰,本文擬對神經系統單基因遺傳病基因診斷策略和問題進行綜述.

一、傳統基因檢測技術的合理選擇

傳統基因檢測技術根據臨床表型特征,對候選基因逐個排查,檢測成本高且檢測時間長,二代基因測序技術可以顯著降低檢測成本、減少檢測時間,尤其對于種類眾多的致病基因.然而對于某些單基因遺傳病,靶向單基因檢測仍作為首選,這些疾病一般具有如下特征:(1)臨床特征明顯,可以結合血液生化、影像學等輔助檢查明確診斷;家族史明確;確定為單基因致病性突變[1].臨床明確診斷后,單基因檢測陽性檢出率較高,如ATP7B基因突變導致的肝豆狀核變性[HLD,亦稱Wilson病(WD)]和DMD基因突變導致的Duchenne型肌營養不良癥(DMD).2016年,Dong等[2]報告大樣本肝豆狀核變性病例的ATP7B基因檢測結果,90.03%患者(569/632)存在2種或以上病理性或可能病理性變異,其中93.85%(534/569)存在14種最常見病理性變異中至少1種,可見單基因檢測對肝豆狀核變性的檢測效率較高.(2)目前尚有部分遺傳性疾病不適宜二代基因測序,如三核苷酸重復突變導致的疾病、亨廷頓病(HD)、部分脊髓小腦共濟失調(SCA)、脆性X染色體綜合征(FXS)等;較大缺失或重復突變導致的疾病如Duchenne型肌營養不良癥、脊髓性肌萎縮癥(SMA)、腓骨肌萎縮癥1A型(CMT1A型)等;基因不明確需特殊檢測,如面?肩?肱型肌營養不良癥(FSHD)等.

選擇傳統基因檢測要求臨床醫師必須具備充足的特殊基因突變致臨床表型的相關知識和豐富的臨床經驗,以及作出正確診斷,極具挑戰性.以腓骨肌萎縮癥為例,包括PMP22基因在內的長度為1.50 Mb串聯重復突變導致的CMT1A型是最常見類型,占40%～50%,約70%常染色體顯性遺傳性CMT1型和90%散發性CMT1型為CMT1A型[3].Saporta等[4]研究顯示,英國和美國CMT1型患者PMP22基因突變陽性檢出率均超過70%,特別是具有典型臨床癥狀且正中神經神經傳導速度(NCV)為15～35 m/s的CMT1型患者,PMP22基因突變陽性檢出率高達89%,因此,對于正中神經神經傳導速度為15～35 m/s的CMT1型患者,應首選PMP22基因檢測,若呈陰性再行其他靶向基因測序.但是由于臨床醫師和電生理學醫師存在技術差異,準確分型成為難點,若PMP22基因呈陰性,再進一步行靶向基因測序套餐檢測,檢測成本可能更高、檢測時間可能更長[4],因此,對于經驗不足的臨床醫師和某些難以臨床診斷的病例,應直接選擇二代基因測序技術更為便捷.

二、基于二代基因測序的目標區域捕獲測序

二代基因測序是一種高通量測序技術,一次運行即可產生數以億計的短片段序列,顯著縮短大規模基因測序時間.通過一系列寡核苷酸探針與全基因組DNA雜交,將基因組特定區域富集,同時進行二代基因測序,是目前應用最廣泛的目標區域捕獲測序技術.通過檢索數據庫和文獻,篩選出某個臨床表型的所有相關致病基因,針對各目標基因外顯子區域進行基因測序,可以涵蓋與個體臨床表型相關的大部分變異.從傳統基因檢測一次僅能檢測一種基因到二代基因測序檢測一個基因組(panel),不僅降低檢測成本、節省檢測時間、提高DNA診斷敏感性,而且簡化臨床醫師選擇基因檢測的策略.關于基因組的選擇,首先,確定與疾病有較強的關聯性、有充足的解讀依據,且已作為單基因檢測;其次,將臨床表型重疊但致病基因不同的一組疾病進行基因組檢測,可資鑒別診斷[1].與全基因組測序(WGS)和全外顯子測序(WES)相比,目標區域捕獲測序更加簡便、經濟,成為目前臨床基因檢測的重心,廣泛應用于神經系統遺傳性疾病的基因檢測.

1.腓骨肌萎縮癥 亦稱遺傳性運動感覺神經病(HMSN),是基因型和臨床表型異質性較強的周圍神經系統遺傳性疾病,致病基因50余種,存在多種遺傳方式.既往推薦的基因診斷策略主要是根據臨床表型和遺傳方式再結合基因突變頻率選擇相應基因檢測[5].PMP22基因突變導致的CMT1A型是腓骨肌萎縮癥的最常見亞型(占40%～50%),其次是MPZ基因點突變導致的CMT1B型(占3%～5%)[6],而絕大多數X連鎖遺傳性腓骨肌萎縮癥為GJB1基因突變所致,是第2位常見亞型(占7%～12%),因此,對于常染色體顯性遺傳性CMT1型和散發性CMT1型患者,首先檢測PMP22基因大片段重復突變,若呈陰性且家系中無男男遺傳,則考慮CMTX1型并檢測GJB1基因,若呈陰性,則行MPZ和PMP22基因點突變分析,若仍呈陰性且條件允許,則進一步行常染色體顯性遺傳性CMT1型其他致病基因如SJMPLE、EGR2、NFL突變分析.由于腓骨肌萎縮癥的遺傳異質性,傳統基因檢測效率較低;隨著二代基因測序技術的發展和檢測成本的降低,通過目標區域捕獲測序技術可以進行基因組檢測,通常將各致病基因外顯子和側翼序列作為目標序列同時檢測,既降低檢測費用,又保證絕大部分致病基因的陽性檢出率,而且也減少意義不明的基因突變分析.其缺點是與全基因組測序和全外顯子測序相比,無法發現新的致病基因.

2.遺傳性痙攣性截癱 遺傳性痙攣性截癱(HSP)是較罕見的具有高度臨床異質性和遺傳異質性的神經系統遺傳性疾病,除表現為雙下肢痙攣性截癱的上運動神經元損害外,還可以合并多種神經系統及其他系統損害,且與某些神經系統遺傳性疾病的臨床表現相重疊,因此,即使是臨床經驗豐富的神經科醫師也難以鑒別診斷.目前已克隆的基因有70余種,逐一檢測,選擇困難且耗時、費力.SPG4型是西方國家最常見的遺傳性痙攣性截癱亞型,系SPASTIN基因突變所致[7],占40%以上,其次是ATL1基因突變導致的SPG3A型[8],再次是REEP1基因突變導致的SPG31型[9],均為常染色體顯性遺傳;而SPG11型、SPG7型和SPG5型是最常見的常染色體隱性遺傳亞型[10],其中,SPG7型表現為突出的小腦癥狀,SPG5型為單純型遺傳性痙攣性截癱,SPG11型為單純型遺傳性痙攣性截癱伴胼胝體變薄.因此,對于常染色體顯性遺傳家系,應依次檢測SPG4、SPG3A和SPG31基因;對于常染色體隱性遺傳家系,應結合臨床癥狀,檢測SPG11、SPG7和SPG5基因;對于散發性或家族史不明確的患者,應優先檢測SPG4和SPG5基因[11].二代基因測序技術可以同時對多個甚至所有已知的遺傳性痙攣性截癱致病基因進行檢測,顯著優化基因檢測策略.2013年,Kumar等[12]采用目標區域捕獲測序對27例SPG4基因陰性的遺傳性痙攣性截癱患者進行10種常染色體隱性和9種常染色體顯性致病基因檢測,發現7例(25.93%)呈陽性結果.Balicza等[13]采用目標區域捕獲測序結合全外顯子測序對58個遺傳性痙攣性截癱家系的先證者進行基因檢測,結果顯示,20例(34.48%)明確診斷.Koutsis等[14]對1例遺傳性痙攣性截癱患者進行2731種已知基因檢測,發現1種新的致病基因--ABCD1基因.根據目前的技術條件,從經濟角度考慮可以先檢測SPG4基因,若呈陰性,再采用二代基因測序技術進行其余基因檢測,若仍呈陰性,則可以考慮行所有致病基因目標區域捕獲測序或全外顯子測序.

3.原發性肌張力障礙 原發性肌張力障礙是單基因遺傳病,目前文獻報道有27種肌張力障礙基因位點,即DYT1～27型.不同基因型致病機制不同,治療效果也不盡相同,因此,通過基因檢測確定基因型十分重要.既往通常根據臨床特點選擇基因,如DYT1型于兒童期或青春期發病,肌張力障礙逐漸自單側肢體進展至全身;DYT5型為多巴反應性肌張力障礙(DRD),表現為晨輕暮重,對左旋多巴反應極佳;DYT8～10型為發作性肌張力障礙,其中DYT10型抗癲藥物(AEDs)治療有效.隨著二代基因測序技術的發展,基因診斷更加簡便、直接,并且在發現新的致病基因和致病性突變中發揮重要作用,Fuchs等[15]采用全外顯子測序發現DYT25型致病基因為GNAL基因;隨后Zech等[16]采用該項技術發現DYT27型致病基因為COL6A3基因.如果根據某種特定臨床表型檢測相關基因后未發現陽性結果,可以選擇目標區域捕獲測序對所有已知基因進行檢測.值得注意的是,對于原發性肌張力障礙,應嚴格把握基因檢測指征,首先確定為肌張力障礙,其次排除繼發性肌張力障礙,這是由于其他因素如藥物不良反應、毒物毒性作用及其他遺傳性疾病也可以引起肌張力障礙,如肝豆狀核變性.進行目標區域捕獲測序前,若患者存在特定臨床表型,可以選擇相應診斷性治療方法,如左旋多巴對多巴反應性肌張力障礙有戲劇性改善效果,卡馬西平對發作性運動誘發性運動障礙(PKD)有顯著療效.如果上述診斷性治療方法仍不能明確診斷或無助于篩選候選基因,則可以考慮采用目標區域捕獲測序對所有DYT基因進行檢測.

4.遺傳性肌病 遺傳性肌病具有高度臨床異質性和遺傳異質性,主要包括肌營養不良癥、先天性肌病、代謝性肌病、神經?肌肉接頭病和離子通道病等,臨床表現復雜且常重疊,相關致病基因種類眾多,且部分基因較大、外顯子較多、致病性突變位點繁多.盡管肌肉病理學檢測有助于候選基因的選擇,但技術要求高且費用昂貴,常不能滿足診斷需求.傳統基因檢測需根據臨床表型逐個檢測候選基因,耗時長、費用高,因此,遺傳性肌病整體基因診斷率較低.目標區域捕獲測序技術的高通量、高選擇性、低成本優點對遺傳性肌病的分子診斷具有明顯優勢.2015年,傅曉娜等[17]采用目標區域捕獲測序對134例遺傳性肌病患兒進行125種相關基因檢測,74例確定致病性突變,陽性檢出率達55.22%,包括代謝性肌病、先天性肌病、Duchenne型肌營養不良癥、Emery?Dreifuss肌營養不良癥(EDMD)、先天性肌營養不良癥(CMD)、抗肌萎縮蛋白病、肢帶型肌營養不良癥(LGMD)等,其中先天性肌營養不良癥包括先天性肌營養不良癥1A型(MDC1A型)、Ullrich型先天性肌營養不良癥(UCMD)、Bethlem肌病、核纖層蛋白相關先天性肌營養不良癥等.Tian等[18]采用目標區域捕獲測序技術對35個肌病家系進行238種相關基因檢測,包括代謝性肌病、先天性肌無力綜合征、先天性肌病、先天性肌營養不良癥、先天性肌強直、運動神經元病(MND)、腓骨肌萎縮癥等,21個家系(60%)存在臨床表型?基因型相匹配的致病性突變,8個家系(22.86%)存在可疑致病性突變.2016年,Kuhn等[19]對58例擬診肢帶型肌營養不良癥但無法臨床分型的患者進行目標區域捕獲測序,包括23種LGMD基因和15種導致近似表型的基因,19例(76%)明確診斷.上述研究結果提示,當特異性臨床表型足以指向某一具體疾病或基因時,應首先選擇特定基因診斷,例如,Duchenne型肌營養不良癥通常于幼年發病,腓腸肌肥大,血清肌酸激酶(CK)水平明顯升高,肌肉病理學顯示抗肌萎縮蛋白(dystrophin)表達缺失,均支持診斷,此時可以直接行DMD基因檢測而不必要行基因組檢測.如果臨床表型提示為一組疾病,如肢帶肌和四肢近端肌無力和肌萎縮,血清肌酸激酶、肌電圖和肌肉組織活檢提示肌源性損害,臨床疑診肢帶型肌營養不良癥,可以考慮行LGMD基因組檢測,如果不能準確分型,則可以考慮目標區域捕獲測序檢測所有相似表型的基因,較逐一檢測成本低、時間短.

三、全外顯子測序或全基因組測序

高通量測序技術的發展和檢測成本的降低,使全外顯子測序和全基因組測序在神經內科臨床和科研中得到廣泛應用.全外顯子測序系通過序列捕獲技術將全基因組外顯子區域靶向捕獲并富集,再進行高通量測序的基因組分析方法[20].人類基因組約含3X109個堿基對,其中僅1%～2%DNA序列編碼蛋白質,約85%的遺傳變異集中于蛋白編碼區,即外顯子.因此,全外顯子測序可以確定大多數罕見神經系統疾病的致病基因[21].全基因組測序可以獲得非編碼區信息,是對全外顯子測序的重要補充,但檢測成本較高,而且由于涉及大量非編碼序列,信息量較大、基因分析較復雜[22].

對于單基因遺傳病,特別是能夠通過單個基因或基因組明確診斷的疾病,采用全外顯子測序甚至全基因組測序,一方面耗費人力和物力,另一方面不能保證足夠的測序深度和廣度,使測序敏感性下降.例如,對于有明確家族史的共濟失調患者,基因組檢測即可檢出常見基因突變,僅當基因組檢測呈陰性時,方啟動全外顯子測序,此時有可能發現新的基因突變位點,如SCA35型致病基因TGM6基因[23].因此,臨床表型難以確定某一基因組的疾病;存在多系統癥狀的疾病,如伴共濟失調的痙攣性截癱(痙攣性截癱基因組檢測呈陰性);經常規基因檢測或表型相關基因組檢測未發現基因突變而臨床表型高度提示單基因遺傳病,方啟動全外顯子測序或全基因組測序[1].值得注意的是,由于捕獲效能的原因,無論是全外顯子測序還是全基因組測序均無法覆蓋全部外顯子和基因組,因此應檢測單核苷酸變異或長度不超過8～10 bp的多核苷酸變異,而不應檢測致病性重復序列或長片段缺失.鑒于此,臨床醫師在制定全外顯子測序和(或)全基因組測序前,應首先仔細分析家族史,明確核心癥候群,再廣泛查閱相關文獻,謹慎決定[20].通常有25%～60%進行全外顯子測序的患者能夠確定致病基因[20,24],然而,測序的同時可以產生大量不確定的基因突變,對其致病性的解讀應嚴格按照國際標準與指南[25].還應注意的是,基因檢測結果的解讀是動態發展的,隨著科學知識的積累,數據意義常發生變化,因此,對于關鍵的候選致病基因,嚴密的功能學試驗有助于確定其致病性并尋找適宜的干預措施.

全外顯子測序和(或)全基因組測序的應用可以顯著加速發現疾病新基因的進程,但測序策略的合理選擇是篩查致病基因的重要保障.對于常染色體隱性遺傳性疾病,分析基因檢測結果時應首先考慮純合突變和復合雜合突變;對于常染色體顯性遺傳性疾病,全外顯子測序常檢測到大量候選雜合突變,故應結合多種策略進一步確定致病性突變.當疾病基因異質性明顯時,基因檢測策略即顯得更加重要.篩查家族性帕金森病致病基因時,常通過大家系或數目眾多的正常對照確定可能的致病基因,如VPS35和DNAJC13基因[26?27].在無足夠大家系的情況下,Farlow等[28]設計兩階段研究方案,包括1個擁有32個帕金森病家系93例帕金森病患者的發現組和1個擁有49例帕金森病患者的重復組,進行全外顯子測序,結果顯示,發現組患者TNK2和TNR基因的可能致病性突變亦見于重復組;發生上述突變的12個家系中TNK2和TNR基因共檢出9種變異,均經Sanger測序證實可能是帕金森病新的可疑致病性突變.

高通量測序技術的推廣必將加速罕見病新的致病基因的發現,同時也將帶來新的問題和挑戰:(1)全外顯子測序可以縮短病因篩查過程,但在絕大多數情況下,尋找到致病性突變并不意味治愈患者.(2)全外顯子測序有時可以意外發現與主要疾病無關的致病性突變,此時臨床醫師應根據臨床需求進行醫療監控,甚至啟動必要的治療措施.(3)全外顯子測序并未覆蓋全部基因組序列,即使呈陰性結果也不能完全排除某種遺傳學病因.因此,當基因檢測得不到確定結論時,臨床醫師和遺傳咨詢師有責任幫助患者及其家屬正確看待檢測結果[29?30].

四、染色體微陣列分析

染色體微陣列分析(CMA)技術可以檢測人類基因組DNA重復和缺失的拷貝數變異(CNV),是一種分子核型分析技術,可以檢出核型分析檢測不到的基因組微缺失或微重復變異.根據芯片設計與檢測原理的不同,染色體微陣列分析技術可以分為兩種類型:基于微陣列的比較基因組雜交(aCGH)技術和單核苷酸多態性微陣列(SNP array)技術[31],主要用于檢測大片段缺失和重復,適用于孤獨癥譜系障礙(ASDs)、兒童精神發育遲緩、先天性畸形等.

染色體微陣列分析技術應用前,兒童精神發育遲緩和先天性畸形的病因診斷是臨床醫師的難題,近10年來其診斷率有所提高.Sagoo等[32]的Meta分析顯示,13 926例經核型分析無異常的精神發育遲緩和先天性畸形患兒中約10%經染色體微陣列分析檢出致病性突變.袁海明等[33]對2000例先天性缺陷(包括智力低下、發育遲緩、多發性畸形、自閉癥、癲等)患兒進行染色體微陣列分析,陽性檢出率達26.10%(522/2000).Roberts等[34]對215例孤獨癥、孤獨癥譜系障礙、發育遲緩或學習障礙患者分別進行包含105X103和180X103個探針的寡核苷酸微陣列分析,結果顯示,45例(20.93%)拷貝數變異,包括49種,其中32種確定為致病性拷貝數變異,余17種臨床意義不明.Schaefer等[35]對68例孤獨癥患兒進行染色體微陣列分析,拷貝數變異陽性檢出率為20.59%(14/68).文獻報道的染色體微陣列分析對孤獨癥和學習障礙的陽性檢出率高于核型分析和脆性染色體檢測.Michelson等[36]總結1980-2009年的7000篇文獻采用不同檢測方法對全面性發育遲緩(GDD)和智力障礙患兒的陽性檢出率,染色體微陣列分析為7.8%,G顯帶核型分析為4%,亞端粒熒光原位雜交(FISH)為3.5%;約10%患兒系X連鎖基因突變所致,其中在有確切X連鎖家族史的男性患兒中約42%可以檢出X連鎖基因突變,例如,2%輕至中度智力障礙患兒可以檢出FMR1基因全擴增,1.5%中至重度全面性發育遲緩或智力障礙女性患兒可以檢出與Rett綜合征相關的MeCP2基因突變.染色體微陣列分析可以用于特發性全面性癲的遺傳風險評價.特發性全面性癲約占所有癲的30%,雖然預測與遺傳因素有關,但絕大多數未檢出致病基因.研究顯示,有1.0%～1.3%單純特發性全面性癲患兒(排除孤獨癥、情感障礙和嚴重智力障礙)可以檢出15q13.3區域CHRNA7基因缺失,該突變與智力障礙、孤獨癥和精神分裂癥有關[37?38].染色體微陣列分析還可以用于其他神經系統疾病的風險評價,Shoichet等[39]采用基于微陣列的比較基因組雜交技術檢測72例散發性肌萎縮側索硬化癥(ALS)患者,檢出11種長度<1 Mb的變異(包括重復突變6種、缺失突變5種),其中5種僅見于肌萎縮側索硬化癥患者,提示拷貝數變異可能是肌萎縮側索硬化癥易感性的候選病因.

然而,染色體微陣列分析的適應癥主要是精神運動發育遲緩、自閉癥、多發性畸形等,且臨床表型多樣的陽性檢出率遠高于單一臨床表型[33].除適應證外,該項技術還存在一定局限性,不能檢出染色體平衡易位,不能檢出點突變和重復突變等,因此,對于染色體微陣列分析呈陰性的患者還應行核型分析、原位熒光雜交或點突變和重復突變檢測.

綜上所述,對于臨床醫師而言,臨床表型是首先獲得的信息,臨床表型和基因型異質性使致病基因的篩選變得復雜.對于某些特征性臨床癥狀,能夠直接指向某一具體疾病和基因,不建議進行大范圍基因檢測,而是首先選擇單一基因檢測;某種臨床表型涉及的基因達數種、數十種甚至數百種,而已知致病基因的臨床表型也有多種,可能存在未發現但與該基因相關的臨床表型,建議選擇目標區域捕獲測序對相關基因進行篩查.在進行檢測結果解讀時,是否為致病性突變位點、基因突變是否與臨床表型一致,臨床醫師不能依賴基因檢測機構的結論,必須對臨床表型和基因型的相關性具備一定識別能力,要有自己的判斷.此外,盡管人類基因組遺傳多態性和致病性突變數據庫信息不斷豐富,但關于許多罕見病的遺傳學數據仍不完善,仍有許多突變位點的致病性尚不確定,二代基因測序技術檢出基因突變及其位點較多,但其致病性信息不足,檢測結果的判斷不準確,可能使部分患者不能明確診斷.因此,基因診斷是一個臨床信息和生物學信息不斷溝通、不斷更新的過程.

[1]XueY,AnkalaA,WilcoxWR,HegdeMR.Solvingthe molecular diagnostic testing conundrum for Mendelian disorders in the era of next?generation sequencing:single?gene,gene panel,or exome/genome sequencing.Genet Med,2015,17:444?451.

[2]Dong Y,Ni W,Chen WJ,Wan B,Zhao GX,Shi ZQ,Zhang Y,Wang N,Yu L,Xu JF,Wu ZY.Spectrum and Classification of ATP7B Variants in a Large Cohort of Chinese Patients with Wilson's Disease Guides Genetic Diagnosis. Theranostics,2016,6:638?649.

[3]Gess B,Schirmacher A,Boentert M,Young P.Charcot?Marie?Tooth disease:frequency of genetic subtypes in aGerman neuromuscular center population.Neuromuscul Disord,2013,23:647?651.

[4]Saporta AS,Sottile SL,Miller LJ,Feely SM,Siskind CE,Shy ME.Charcot?Marie?Tooth disease subtypes and genetic testing strategies.Ann Neurol,2011,69:22?33.

[5]Zhang RX,Tang BS.Classification and molecular diagnostic procedure for Chacort?Marie?Tooth diseas.Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi,2012,29:553?557[.張如旭,唐北沙.腓骨肌萎縮癥的分型與分子診斷流程.中華醫學遺傳學雜志,2012,29:553?557.]

[6]Birouk N,Gouider R,Guern E,Gugenheim M,Tardieu S,Maisonobe T,Forestier N,Agid Y,Brice A,Bouche P.Charcot?Marie?Tooth disease type 1A with 17p11.2 duplication:clinical and electrophysiological phenotype study and factors influencing disease severity in 119 cases.Brain,1997,120:813?823.

[7]Hazan J,Fonknechten N,Mavel D,Paternotte C,Samson D,Artiguenave F,Davoine CS,Cruaud C,Dürr A,Wincker P,Brottier P,Cattolico L,Barbe V,Burgunder JM,Prud'homme JF,Brice A,Fontaine B,Heilig B,Weissenbach J.Spastin,a new AAA protein,is altered in the most frequent form of autosomal dominant spastic paraplegia.Nat Genet,1999,23:296?303.

[8]Sauter SM,Engel W,Neumann LM,Kunze J,Neesen J.Novel mutations in the Atlastin gene (SPG3A)in families with autosomal dominant hereditary spastic paraplegia and evidence for late onset forms of HSP linked to the SPG3A locus.Hum Mutat,2004,23:98.

[9]Hewamadduma C,McDermott C,Kirby J,Grierson A,Panayi M,Dalton A,Rajabally Y,Shaw P.New pedigrees and novel mutation expand the phenotype of REEP1?associated hereditary spastic paraplegia(HSP).Neurogenetics,2009,10:105?110.

[10]Stevanin G,Santorelli FM,Azzedine H,Coutinho P,Chomilier J,Denora PS,Martin E,Ouvrard?Hernandez AM,Tessa A,Bouslam N,Lossos A,Charles P,Loureiro JL,Elleuch N,Confavreux C,Cruz VT,Ruberg M,Leguern E,Grid D,Tazir M,Fontaine B,Filla A,Bertini E,Durr A,Brice A.Mutations in SPG11,encoding spatacsin,are a major cause of spastic paraplegia with thin corpus callosum.Nat Genet,2007,39:366?372.

[11]Rong TY,Chen SD.The clinical features and the strategy of genetic diagnosis in hereditary spastic paraplegia.Zhen Duan Xue Li Lun Yu Shi Jian,2011,10:175?178[.戎天藝,陳生弟.遺傳性痙攣性截癱的臨床表現與基因診斷策略.診斷學理論與實踐,2011,10:175?178.]

[12]Kumar KR,Blair NF,Vandebona H,Liang C,Ng K,Sharpe DM,Grünewald A,G?lnitz U,Saviouk V,Rolfs A,Klein C,Sue CM.Targeted next generation sequencing in SPAST?negative hereditary spastic paraplegia.J Neurol,2013,260:2516?2522.

[13]Balicza P,Grosz Z,Gonzalez MA,Bencsik R,Pentelenyi K,Gal A,Varga E,Klivenyi P,Koller J,Züchner S,Molnar JM.Genetic background of the hereditary spastic paraplegia phenotypes in Hungary?An analysis of 58 probands.J Neurol Sci,2016,364:116?121.

[14]Koutsis G,Lynch DS,Tucci A,Houlden H,Karadima G,Panas M.A novelABCD1 mutation detected bynextgeneration sequencing in presumed hereditary spastic paraplegia:a 30?year diagnostic delay caused by misleading biochemical findings.J Neurol Sci,2015,355:199?201.

[15]FuchsT,Saunders?Pullman R,Masuho I,Luciano MS,Raymond D,Factor S,Lang AE,Liang TW,Trosch RM,White S, Ainehsazan E, HervéD, Sharma N, Ehrlich ME,MartemyanovKA,Bressman SB,OzeliusLJ.Mutationsin GNAL cause primary torsion dystonia.Nat Genet,2013,45:88?92.

[16]Zech M,Lam DD,Francescatto L,Schormair B,Salminen AV,Jochim A,Wieland T,LichtnerP,Peters A,GiegerC,Lochmüller H, Strom TM, Haslinger B, Katsanis N,Winkelmann J.Recessive mutations in the α 3(VI)collagen gene COL6A3 cause early?onset isolated dystonia.Am J Hum Genet,2015,96:883?893.

[17]Fu XN,Liu AJ,Yang HP,Wei CJ,Ding J,Wang S,Wang JM,Yuan Y,Jiang YW,Xiong H.Application oftargeted technology and next generation sequencing in molecular diagnosis of inherit myopathy.Zhonghua Er Ke Za Zhi,2015,53:741?746[.傅曉娜,劉愛杰,楊海坡,魏翠潔,丁娟,王爽,王靜敏,袁云,姜玉武,熊暉.靶向捕獲二代測序技術在遺傳性肌病診斷中的應用.中華兒科雜志,2015,53:741?746.]

[18]Tian X,Liang WC,Feng Y,Wang J,Zhang VW,Chou CH,Huang HD,Lam CW,Hsu YY,Lin TS,Chen WT,Wong LJ,Jong YJ. Expanding genotype/phenotype of neuromuscular diseases by comprehensive target capture/NGS.Neurol Genet,2015,1:E14.

[19]Kuhn M,Gl?ser D,Joshi PR,Zierz S,Wenninger S,Schoser B,Deschauer M.Utility of a next?generation sequencing?based gene panel investigation in German patients with genetically unclassified limb?girdle muscular dystrophy.J Neurol,2016,263:743?750.

[20]Yang Y,Muzny DM,Reid JG,Bainbridge MN,Willis A,Ward PA,Braxton A,Beuten J,Xia F,Niu Z,Hardison M,Person R,Bekheirnia MR,Leduc MS,Kirby A,Pham P,Scull J,Wang M,Ding Y,Plon SE,Lupski JR,Beaudet AL,Gibbs RA,Eng CM.Clinical whole?exome sequencing for the diagnosis of mendelian disorders.N Engl J Med,2013,369:1502?1511.

[21]Choi M,Scholl UI,Ji W,Liu T,Tikhonova IR,Zumbo P,Nayir A,Bakkaloglu A,Ozen S,Sanjad S,Nelson?Williams C,Farhi A,Mane S,Lifton RP.Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallel DNA sequencing.Proc Natl Acad Sci USA,2009,106:19096?19101.

[22]McCarthy MI,Abecasis GR,Cardon LR,Goldstein DB,Little J,Ioannidis JP,Hirschhorn JN.Genome?wide association studies for complex traits:consensus,uncertainty and challenges.Nat Rev Genet,2008,9:356?369.

[23]Wang JL,Yang X,Xia K,Hu ZM,Weng L,Jin X,Jiang H,Zhang P,Shen L,Guo JF,Li N,Li YR,Lei LF,Zhou J,Du J,Zhou YF,Pan Q,Wang J,Wang J,Li RQ,Tang BS.TGM6 identified as a novel causative gene of spinocerebellar ataxias using exome sequencing.Brain,2010,133:3510?3518.

[24]Gilissen C,Hoischen A,Brunner HG,Veltman JA.Disease gene identification strategies for exome sequencing.Eur J Hum Genet,2012,20:490?497.

[25]Richards S,Aziz N,Bale S,Bick D,Das S,Gastier?Foster J,Grody WW,Hegde M,Lyon E,Spector E,Voelkerding K,Rehm HL;ACMG Laboratory Quality Assurance Committee.Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants:a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology.Genet Med,2015,17:405?424.

[26]Vilari?o?Güell C,Wider C,Ross OA,Dachsel JC,Kachergus JM,Lincoln SJ,Soto?Ortolaza AI,Cobb SA,Wilhoite GJ,Bacon JA,Behrouz B,Melrose HL,Hentati E,Puschmann A,Evans DM,Conibear E,Wasserman WW,Aasly JO,Burkhard PR,Djaldetti R,Ghika J,Hentati F,Krygowska?Wajs A,Lynch T,Melamed E,Rajput A,Rajput AH,Solida A,Wu RM,Uitti RJ,Wszolek ZK,Vingerhoets F,Farrer MJ.VPS35 Mutations in Parkinson Disease.Am J Hum Genet,2011,89:162?167.

[27]Vilari?o?Güell C,Rajput A,Milnerwood AJ,Shah B,Szu?Tu C,Trinh J,Yu I,Encarnacion M,Munsie LN,Tapia L,Gustavsson EK,Chou P,Tatarnikov I,Evans DM,Pishotta FT,Volta M,Beccano?Kelly D,Thompson C,Lin MK,Sherman HE,Han HJ,Guenther BL,Wasserman WW,Bernard V,Ross CJ,Appel?Cresswell S,Stoessl AJ,Robinson CA,Dickson DW,Ross OA,WszolekZK,AaslyJO,WuRM,HentatiF,GibsonRA,McPherson PS,Girard M,Rajput M,Rajput AH,Farrer MJ.DNAJC13 mutations in Parkinson disease.Hum Mol Genet,2014,23:1794?1801.

[28]Farlow JL,Robak LA,Hetrick K,Bowling K,Boerwinkle E,Coban?Akdemir ZH,Gambin T,Gibbs RA,Gu S,Jain P,Jankovic J,Jhangiani S,Kaw K,Lai D,Lin H,Ling H,Liu Y,Lupski JR,Muzny D,Porter P,Pugh E,White J,Doheny K,Myers RM,Shulman JM,Foroud T.Whole?exome sequencing in familial Parkinson disease.JAMA Neurol,2016,73:68?75.

[29]Hayden EC.Sequencing set to alter clinical landscape.Nature,2012,482:288.

[30]BowdinS,GilbertA,BedoukianE,Carew C,Adam MP,Belmont J,Bernhardt B,Biesecker L,Bjornsson HT,Blitzer M,D'Alessandro LC,Deardorff MA,Demmer L,Elliott A,Feldman GL,Glass IA,Herman G,Hindorff L,Hisama F,Hudgins L,Innes AM,Jackson L,Jarvik G,Kim R,Korf B,Ledbetter DH,Li M,Liston E,Marshall C,Medne L,Meyn MS,Monfared N,Morton C,Mulvihill JJ,Plon SE,Rehm H,Roberts A,Shuman C,Spinner NB,Stavropoulos DJ,Valverde K,Waggoner DJ,Wilkens A,Cohn RD,Krantz ID.Recommendations for the integration of genomics into clinical practice.Genet Med,2016,18:1075?1084.

[31]Cooperative Group of Application of Chromosomal Microarray Analysis in Prenatal Diagnosis. Expert consensus about application ofchromosomalmicroarray analysis in prenatal diagnosis.Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi,2014,49:570?572[.染色體微陣列分析技術在產前診斷中的應用協作組.染色體微陣列分析技術在產前診斷中的應用專家共識.中華婦產科雜志,2014,49:570?572.]

[32]Sagoo GS,Butterworth AS,Sanderson S,Shaw?Smith C,Higgins JP,Burton H.Array CGH in patients with learning disability(mental retardation) and congenital anomalies: updated systematic review and meta?analysis of 19 studies and 13 926 subjects.Genet Med,2009,11:139?146.

[33]Yuan HM,Zhu JP,Deng XY,Chen MF,Li XW,Li QL,Lü F.Chromosomalmicroarray analysis of2000 pediatric cases.Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi,2016,33:247?251[.袁海明,朱鈞萍,鄧小燕,陳夢帆,李欣蔚,李秋麗,呂芬.染色體微陣列技術在2000例兒科患者中的應用.中華醫學遺傳學雜志,2016,33:247?251.]

[34]Roberts JL,Hovanes K,Dasouki M,Manzardo AM,Butler MG.Chromosomalmicroarray analysisofconsecutive individuals with autism spectrum disorders or learning disability presenting for genetic services.Gene,2014,535:70?78.

[35]Schaefer GB,Starr L,Pickering D,Skar G,Dehaai K,Sanger WG.Array comparative genomic hybridization findings in a cohort referred for an autism evaluation.J Child Neurol,2010,25:1498?1503.

[36]Michelson DJ,Shevell MI,Sherr EH,Moeschler JB,Gropman AL,Ashwal S.Evidence report:genetic and metabolic testing on children with global developmental delay:report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology and the Practice Committee of the Child Neurology Society.Neurology,2011,77:1629?1635.

[37]Helbig I,Mefford HC,Sharp AJ,Guipponi M,Fichera M,Franke A,Muhle H,de Kovel C,Baker C,von Spiczak S,Kron KL,Steinich I,Kleefuss?Lie AA,Leu C,Gaus V,Schmitz B,Klein KM,Reif PS,Rosenow F,Weber Y,Lerche H,Zimprich F,Urak L,Fuchs K,Feucht M,Genton P,Thomas P,Visscher F,de Haan GJ,M?ller RS,Hjalgrim H,Luciano D,Wittig M,Nothnagel M,Elger CE,Nürnberg P,Romano C,Malafosse A,Koeleman BP,Lindhout D,Stephani U,Schreiber S,Eichler EE, Sander T. 15q13.3 microdeletions increase risk of idiopathic generalized epilepsy.Nat Genet,2009,41:160?162.

[38]Dibbens LM,Mullen S,Helbig I,Mefford HC,Bayly MA,Bellows S,Leu C,Trucks H,Obermeier T,Wittig M,Franke A,Caglayan H,Yapici Z;EPICURE Consortium;Sander T,Eichler EE,Scheffer IE,Mulley JC,Berkovic SF.Familial and sporadic 15q13.3 microdeletions in idiopathic generalized epilepsy:precedent for disorders with complex inheritance.Hum Mol Genet,2009,18:3626?3631.

[39]Shoichet SA,Waibel S,Endruhn S,Sperfeld AD,Vorwerk B,Müller I,Erdogan F,Ludolph AC,Ropers HH,Ullmann R.Identification ofcandidate genes forsporadic amyotrophic lateral sclerosis by array comparative genomic hybridization.Amyotroph Lateral Scler,2009,10:162?169.

Strategies and problems of genetic diagnosis for neurogenetic diseases

LI Xun?hua,CHEN Ding?bang,WU Chao
Department of Neurology,the First Affiliated Hospital,Sun Yat?sen University,Guangzhou 510080,Guangdong,China

LI Xun?hua(Email:lxh59xyh@sina.com)

Neurogenetic diseases are difficult to diagnose due to complicated phenotypes.Genetic testing is always the option for final diagnosis.With the progress and update of molecular diagnostic techniques,especially widely usage of next?generation sequencing(NGS),choosing proper sequencing methods is a new challenge. This paper aims to review different strategies and problems of genetic diagnosis for monogenic neurogenetic diseases based on clinical phenotypes,gene mutation characteristics and gene sequencing methodology.

Genetic diseases,inborn; Nervous system diseases; Genes; Review

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81171070).

10.3969/j.issn.1672?6731.2017.07.002

國家自然科學基金資助項目(項目編號:81171070)

510080廣州,中山大學附屬第一醫院神經科

李洵樺(Email:lxh59xyh@sina.com)

2017?05?26)