安徽銅陵白姜姜瘟病病原鑒定

胡洪濤++朱志剛++閔勇++楊自文++黃大野++姚經武++楊妮娜++龍同++程賢亮

摘 要：通過田間調查發現，銅陵白姜姜瘟病在銅陵當地表現出木質部黃心和黑心2種癥狀，通過TTC平板分離、致病性測定、16S rDNA以及青枯菌特異性鞭毛基因（fliC）檢測表明，導致2種不同姜瘟病癥狀的病原菌均為青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum），但二者致病性存在明顯差異。

關鍵詞：銅陵；白姜；姜瘟病；青枯雷爾氏菌；病原鑒定

中圖分類號：S632.5 文獻標識碼：A 文章編號：1001-3547（2016）24-0075-04

由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum，簡稱青枯菌）侵染造成的細菌性青枯病是世界性重要病害之一，該菌可侵染54個科的450多種植物[1]，但以茄科作物，如番茄、馬鈴薯等，受害最為嚴重。生姜青枯病，因其發病快、死亡率高、無有效防治手段，所以俗稱姜瘟病[2]。安徽銅陵白姜種植歷史悠久，姜塊色白鮮嫩汁多、香味純正、品質優良，并具藥用價值，宋朝時被列為朝廷貢品，被譽為銅陵“八寶”之一。銅陵白姜種植面積約為400 hm2，年產量約為4 000 t，年產值近億元，是當地重要的特色農業產業[3]。銅陵市義安區是銅陵白姜主產區，近年來該區姜瘟病的發生日益嚴重，連作田發病率50%以上，重病田甚至絕收，已經嚴重阻礙了當地生姜產業的可持續發展[3]。盡管對姜瘟病的研究進行多年，然而對銅陵姜瘟病病原的研究甚少。為此，開展了銅陵白姜姜瘟病病原檢測的研究，以期為進一步有效防治該病提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

2016年5～8月，在銅陵市義安區興化村等主要白姜產區分別挖取葉部呈現萎蔫狀的生姜姜塊，用清水將其表面泥土沖洗干凈，吸水紙吸干，冰盒保存帶回實驗室。

1.2 病原菌分離

病原菌分離均于采樣后48 h內在超凈工作臺（北京東聯哈爾儀器制造有限公司，型號A2）上完成。樣品先用無菌水沖洗3遍，晾干至表面無明顯水滴，在75%的酒精中浸泡2～3 min，再用無菌水沖洗3遍，晾干至表面無明顯水滴，用消毒刀片在姜塊中部表面切一道長2～4 cm、深約2 mm的切口，用消毒鑷子將其掰開，并用消毒牙簽蘸取姜塊中間部位汁液，在TTC平板上劃線分離[4]。將分離平板置

于28℃培養箱培養24～72 h，所得單菌落超低溫

（-80℃）保存于25%甘油管中。

1.3 致病性測定

病原菌制備：將病原分離物，接種于SPA液體培養基[5]，搖床（北京東聯哈爾儀器制造有限公司，型號DLHR-Q200）發酵48 h（28℃，150 r/min）后，將分光光度計（上海光學儀器721型）OD560值調至1.0，測定菌液濃度約為1×108 CFU/mL，備用。

將溫室生長至5～8葉的銅陵白姜植株從營養缽中取出，用清水將根部沖洗干凈，用消毒針在莖基部刺3個深度和間隔均約為1 cm的針孔，而后將根系置入病原菌發酵液中浸泡20 min。無菌水處理作為對照。每處理5株，重復2次。處理后的植株立即種植于營養缽中，置于人工氣候箱（光周期

12 h/8 h，溫度30℃，濕度85%）內培養7～10 d。

1.4 16S rDNA檢測

純化后的病原分離物直接用PCR擴增，采用16S rDNA通用引物對（F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），PCR反應體系（50 μL）：2×ES Taq Mix 25μL，正反引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 22 μL。反應條件：95℃ 1 min，95℃ 30 s，58℃ 1 min，72℃ 1.5 min，30個循環，72℃ 5 min。引物合成和PCR產物測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

1.5 青枯菌鞭毛基因（fliC）基因檢測

根據NCBI中青枯菌鞭毛基因（fliC）序列設計引物對（F：5'-GAACGCCAACGGTGCGAACT-3'，R：5'-GGCGGCCTTCAGGGAGGTC-3'）。反應體系和條件同1.4。

1.6 進化樹分析

進化樹分析在MEGA 7.0中完成。首先，采用Clustalw進行DNA序列比對（DNA Weight Matrix：IUB，其他采用默認參數）。進化樹的構建采用Maxium Likehood方法、Tamura-Nei模式。

2 結果與分析

2.1 姜瘟病田間癥狀

在銅陵義安村田間調查表明，感染植株在患病初期，葉片褪綠，葉尖和葉緣先黃化，逐漸萎縮反卷下垂（圖1A、B），病葉逐步從基部向上發展，至全株枯死。病株莖基部逐漸變軟，維管束變色褐化、呈水漬狀，擠壓時，有污白色菌膿流出。患病姜塊變軟、維管束變色，根據維管束顏色，可分為黃色和黑色2種，俗稱為黃心（圖1C-a）和黑心（圖1C-b）。黑心和黃心患病植株的姜塊木質部分別呈現黃色、黑色，而地上部癥狀無明顯差異，但相對于黃心癥狀，黑心癥狀病株萎蔫更快，病程更短。

2.2 致病性測試

致病性測試結果顯示，在接種后12 d后，植株葉片呈現萎蔫狀、卷縮，葉尖和葉緣失綠黃化，與田間病株癥狀完全一致（圖2），表明所分離的病原物為姜瘟病病原。然而，接種黑心癥狀病原的植株萎蔫程度更甚、失綠更為嚴重，提示黑心癥狀病原的致病性可能更強。

2.3 病原形態鑒定

導致白姜黑心和黃心癥狀的病原分離物在TTC培養基菌落均為近圓形或梭形，中間略微凸起、中間粉紅色至紅色、周圍為白色。病原菌均為單胞、桿狀，大小為（0.5～0.7）μm×（1.5～2.0）μm，革蘭氏染色陰性，而結晶紫染色顯示兩極著色深，與前人報道一致[6，7]。

2.4 16S rDNA測序

采用16S rDNA通用引物對擴增和測序，結果表明，2種癥狀病原分離物的16S rDNA產物長度均為1 439 bp（NCBI序列號：KX785159.1和KX785160.1）。黃心和黑心癥狀病原的16S rDNA序列與NCBI里保存的青枯雷爾氏菌有高度相似性（>99%）（圖3），而與其他菌如Bukholderia、Bacillus等，親緣關系相對較遠，表明無論是黃心還是黑心癥狀病原菌均為青枯雷爾氏菌。

2.4 青枯菌特異性鞭毛基因（fliC）檢測

為進一步確定銅陵白姜姜瘟病病原，根據前人研究結果[8]，針對青枯菌特異性鞭毛基因（fliC）在NCBI上設計了1對引物，用于青枯菌特檢測，結果如圖4所示。測序結果顯示，黃心和黑心癥狀的青枯菌fliC基因PCR產物長度分別為368、370 bp。由于5'端20～30 bp和3'端10 bp測序質量較低，因此，將兩端低質量的堿基去掉，所得序列與NCBI中所保存的青枯菌fliC基因序列進行比對。如圖5所示，導致白姜黃心和黑心癥狀的青枯菌fliC基因序列與NCBI保存的青枯菌完全一致。綜上所述，可以確定導致銅陵白姜黃心和黑心癥狀姜瘟病的病原均為青枯菌。

3 討論與結論

銅陵白姜為我國具有地方特色的名特優農產品，而近年來，日益嚴重的姜瘟病已經給當地白姜生產造成嚴重的經濟損失，制約了白姜產業的健康、可持續發展。然而長期以來，缺乏對其病原菌的科學鑒定。本研究通過實地調研，發現姜瘟病病株表現為黃心和黑心2種不同癥狀，而通過TTC平板分離、形態學、致病性測定和分子生物學等手段，對銅陵白姜姜瘟病病株進行分離和鑒定，明確其病原均為青枯菌，但二者的致病性存在明顯差異。

16S rDNA序列分析是植物病原細菌鑒定和分類的重要手段和依據 [9]。經序列比較和系統進化樹分析證明銅陵白姜姜瘟病2種癥狀的病原與已知青枯菌在同一分支。然而，盡管2種癥狀病原遺傳距離相當近，但仍然存在微小差距。盡管青枯菌特異性鞭毛基因擴增結果表明，黃心和黑心癥狀病原的序列與已知青枯菌完全一致，但由于致病性和16S rDNA序列存在差異，提示導致黃心和黑心癥狀青枯菌可能為不同的株系或者分化型[8]。前人研究表明，不同地區或寄主的青枯菌表現出明顯生理分化或菌系多樣性[10]，而在地理位置和寄主相同的情況下，發現毒力差異性的青枯菌的相關報道尚不多見。青枯菌的致病性受多種基因調控[11]，如果能從基因組學角度，深入研究其在DNA和轉錄組水平方面的差異，將有助于揭示青枯菌致病性的調控機制[12]。

參考文獻

[1] Hayward A C. Biology and epidemiology of bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum[J]. Annual Review of Phytopathology， 1991（29）： 65-87.

[2] 劉銘，張敏，戢俊臣，等.中國姜瘟病的研究進展[J].中國農學通報，2005（6）：337-340.

[3] 趙友前，趙德明，汪濤，等.銅陵縣白姜姜瘟病的致病因素及防治技術[J].現代農業科技，2012（7）：177.

[4] 方中達.植病研究方法[M].北京：中國農業出版社，1998：156-211.

[5] 車建美，劉波，張彥，等.青枯雷爾氏菌致病性生物測定方法的研究[J].福建農業學報，2011，26（5）：804-807.

[6] 陳莉，高智謀，楊自保，等.安徽省姜瘟病病原細菌鑒定及有效藥劑篩選[J].安徽農業科學，2007，35（18）：5 479，

5 516.

[7] 趙志祥，嚴婉榮，陳圓，等.海南生姜青枯病病原菌鑒定[J]. 基因組學與應用生物學，2015，34（4）：763-768.

[8] Sch？觟nfeld J， Heuer H， Van Elsas J D， et al. Specific and sensitive detection of Ralstonia solanacearum in soil on the basis of PCR amplification of fliC fragments [J]. Applied Environmental Microbiology， 2003， 69（12）： 7 248-7 256.

[9] Weisburg W G， Barns S M， Pelletier D A， et al. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J]. Journal of Bacteriology， 1991， 173（2）： 697-703.

[10] 徐進，顧鋼，潘哲超，等.福建煙草青枯菌演化型及生化變種鑒定研究[J].中國煙草學報，2010，16（6）：66-71.

[11] 蔡劉體，劉艷霞，石俊雄.青枯菌致病力的主要決定因子研究進展[J].貴州農業科技，2015，43（8）：109-113.

[12] Salanoubat M， Genin S， Artiguenave F， et al. Genome sequence of the plant pathogen Ralstonia solanacearum [J]. Nature， 2002， 415（6 871）： 497-502.