蘄蛇乙醇提取物多肽成分的蛋白組學研究

林晨 溫成平 范永升

·實驗研究·

蘄蛇乙醇提取物多肽成分的蛋白組學研究

林晨 溫成平 范永升

目的通過蛋白質組學方法分析蘄蛇乙醇提取物中的多肽類成分。方法雙向凝膠電泳技術分離多肽，染色后切取多肽斑點膠內酶切，利用基質輔助激光解吸離子飛行時間串聯質譜（MALDI-TOF-MS/MS）分析酶切后抽提的肽段，獲取的質譜數據進一步用于數據庫檢索，鑒定相關肽段序列。結果采用稀乙醇熱浸法每克蘄蛇藥材多肽溶出率為5.48%。凝膠圖像顯示各等電點區間均有2kDa的多肽分布，無法通過串聯質譜數據結合數據庫檢索方式有效鑒定，而在15kDa區間存在的膠點中高置信度匹配到多個肽段。結論采用稀乙醇熱浸法能有效提取蘄蛇干燥藥材中的多肽成分。

蘄蛇；多肽；蛋白質組學；凝膠電泳；質譜鑒定

中藥蘄蛇為蝰科動物五步蛇Agkistrodon acutus（Guenther）的干燥體，具有祛風散寒，舒筋活絡的功效，《景岳全書》稱頌其“風毒惡瘡，俱為要藥”[1]。近年研究表明，蘄蛇含有核苷類[2]和磷脂類[3]成分，但對這些成分的生物活性并無相關報道。另一方面，蘄蛇屬于動物藥，以干燥蛇體入藥，富含蛋白質，藥材中總氨基酸含量接近70%[4]，但一直以來對這類成分的研究較少。劉訓紅等[5]早期研究從蘄蛇提取物中測得一類分子量未知的酸性蛋白，丁興紅等[2]通過生物酶解方法從蘄蛇中提取出130kDa的Ⅱ型膠原蛋白，具有炎癥抑制活性[6-7]。最近，柴士偉等[8]以蘄蛇藥材中四種氨基酸總含量為指標來優化湯劑的煎煮工藝。但目前對傳統的酒浸、煎煮提取方法中獲取的肽類成分的表征及其活性尚無相關研究報道。

基于生物質譜技術的蛋白質組學研究相比傳統的蛋白質鑒定方法（如免疫學或氨基酸末端測序），簡化了蛋白純化流程，能夠高通量、高靈敏度分析復雜樣品，在中藥復雜體系作用機制的分析中得到廣泛應用。目前生物質譜的蛋白質鑒定可分為自上而下（top-down）以及自下而上（bottom-up）的兩種策略，top-down策略由于數據庫搜索算法的局限性和較高的假陽性率，使其在蛋白質鑒定的質量控制方面的問題十分突出，bottom-up策略將蛋白質酶解成肽段再進行分析，帶電量較低，能夠獲得更小的分析物相對分子質量，有利于提高質譜檢測的靈敏度[9]。本研究基于凝膠電泳的top-down策略研究蘄蛇乙醇提取物中的多肽成分，通過雙向凝膠電泳以及MALDI-TOF-TOF MS串聯質譜分析，有效分離和識別溶出的多肽，為進一步探討蘄蛇肽類成分的功能活性及藥效提供依據。

1 材料

1.1 儀器KTA purifier 100蛋白純化系統（美國GE公司）；Scientific Appliskan酶標儀（ThermoFisher公司）；PROEAN IEF等電點聚焦儀（美國Bio-Rad公司）；PROTEANⅡxi垂直電泳槽（美國Bio-Rad公司）；5800 MALDI-TOF/TOFтм串聯質譜儀（美國AB SCIEX公司）；ALPHA 1-2 LD plus冷凍干燥機（德國Christ公司）；默克密理博Synergy超純水儀（德國Merck公司）；ST 8R離心機（ThermoFisher公司）；BS423S分析天平（sartorius公司）；DZG-6020真空烘箱（杭州卓馳儀器有限公司）。

1.2 試劑無水乙醇（杭州龍山精細化工有限公司，批號20140114），氯化鈉（上海試四赫維化工有限公司，批號20150710）均為市售分析純。四甲基乙二胺（TEMED），過硫酸銨（AP），1.5M Tris二硫蘇糖醇（DTT），碘乙酰胺（IAA），11cm非線性IPG膠條，pH3-10兩性電解液，30%丙烯酰胺預混溶液，precision plus蛋白mark（貨號161-0377）均購自美國Bio-Rad公司；5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（貨號P0015，上海碧云天生物技術研究所），考馬斯亮藍G-250（貨號北京索萊寶科技有限公司），溴酚藍（美國sig-ma公司），1×PBS磷酸鹽緩沖液（杭州吉諾生物醫藥技術有限公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。

1.3 供試藥材蘄蛇藥材由浙江中醫藥大學中藥飲片有限公司提供，粉碎過80目篩備用。

2 方法

2.1 溶出率測定參照2010版《中國藥典》Ⅰ部附錄ⅩA：浸出物測定法下的熱浸法[10]所述，稱取藥材粉末25.024g，烘干30min，加入10倍量50%稀乙醇，密閉回流提取，溶液沸騰后保持微沸1h后室溫冷卻，收集溶液，5000×g離心20min，棄去底部藥渣沉淀，收集上清液，0.45μm超濾膜濾過。吸取10μL提取液，BCA法測定中多肽濃度，按照試劑盒說明操作。重復3次取均值，計算提取液中多肽成分的含量和溶出率。

2.2 樣品處理提取液-20℃靜置過夜，待絮狀沉淀完全析出，5000×g離心30min，棄去上清，收集沉淀，-56℃凍干后保存。

取出凍干樣品，加入20mmol/L PBS磷酸緩沖液10mL完全復溶，BCA法測定溶液中多肽的濃度。

2.3 雙向凝膠電泳參照文獻[11]進行雙向凝膠電泳分析。等點聚焦用11cm IPG預制膠條（pH3～10非線性）。凍干樣品500μg溶解于400μL水化緩沖液（0.2%Bio-Lyte 3/10ampho兩性電解質，0.001%溴酚藍），膠內被動水化上樣，膠條溶脹時間18h。等點聚焦時長為30 000V hr，膠條依次在平衡液1和平衡液2中震蕩浸潤15min后轉入16%分離膠，20mA恒定電流30min，25mA恒定電流繼續電泳7.5h。電泳結束后迅速剝離凝膠，置于考馬斯亮藍染色液中，染色液配制方法參照文獻[12]。凝膠脫色至背景清晰后放入EXQuest spot cutter切膠系統，選取顯色清晰的膠點精細切取。

2.4 質譜分析切取的凝膠用50mmol/L碳酸氫銨/乙腈振蕩清洗，膠粒脫色完全后用測序級胰蛋白酶37℃膠內酶解過夜提取多肽，用Zip Tip脫鹽后合并酶解液凍干。凍干后的酶解樣品用20%乙腈完全復溶，吸取1μL和CHCA基質溶液按2:1體積比混合后點樣，自然干燥后，樣品靶用氮氣吹凈放入儀器進靶槽，用串聯飛行時間質譜儀（5800MALDI-TOF/ TOF，AB SCIEX）進行測試分析。質譜檢測參數：激光源為波長355nm的Nd：YAG激光器，加速電壓為2kV，采用正離子反射模式和自動獲取數據的模式采集數據，一級質譜（MS）掃描范圍為800～000Da，選擇信噪比>50的母離子進行二級質譜（MS/MS）分析，每個樣品點上選擇8個母離子，二級質譜（MS/MS）累計疊加2500次，碰撞能量2kV。

2.5 數據庫檢索質譜原始文件用Mascot2.2軟件檢索NCBI中的有鱗目（Squamata）蛋白質數據庫，尋找匹配的肽段序列及相關蛋白質。搜庫參數如下：Typeofsearch：Combined（MS+MS/MS）；Enzyme：Trypsin；Fixedmodifications：Carbamidomethyl（C）；Dynamical modifications：Oxidation（M）；Mass values：Monoisotopic；PeptideMassTolerance：±100ppm；FragmentMassTolerance：±0.4Da；PeptideCharge State：1+；Max Missed Cleavages：1

3 結果與分析

3.1 多肽溶出率烘干后，藥材粉末稱重為24.817g。BAC法測定不同濃度蛋白標準液對應的吸光度，并繪制成0～0.5mg/mL濃度區間內的標準曲線，標準曲線方程為：y=0.9628x-0.1201（R2=0.9978），計算醇提液中總蛋白含量為1.360g，計算肽類成分溶出率為5.48%。

3.2 凝膠電泳分析凝膠圖像顯示，蘄蛇藥材經過稀乙醇熱浸，溶出多種肽類成分，其中2kDa左右的多肽在弱酸性、中性及弱堿性的等電點（PI）區間內均有分布；在接近中性PI的區域發現兩個多肽膠點，相對分子量在15kDa（圖1，封底）。

3.3 肽段質譜鑒定凝膠中的多肽膠點經過脫色和測序級trypsin胰蛋白酶酶解后抽提膠內的肽段，采用MALDI-TOF-TOF MS串聯質譜分析。獲得的數據采用一級肽指紋質量與二級肽碎片質量綜合分析法Combin-ed（MS+MS/MS），用MASCOT在NCBI有鱗目（Squamata）蛋白質庫進行搜索；一、二級質譜綜合得分及可信度參數分別設定為Protein Score≥60，Protein Score CI%≥95%。其中，從2號膠點酶解肽段的一級質譜選擇質量質量較高的5個母離子（圖2，封底），對其碎片進行二級質譜鑒定，最終匹配到5個肽段，總分為323，屬于木紋響尾蛇（Crotalus horridus）以及東部菱背響尾蛇（Crotalus adamanteus）的骨骼肌肌動蛋白（Actin，alpha skeletal muscle），氨基酸序列分別為GYSFVTTAER（圖3A，封底），AVFPSIVGRPR（圖3B，封底），QEYDEAGPSIVHR（圖3C，封底），IWHHTFY-NELR（圖3D，封底），SYELPDGQVITIGNER（圖3E，封底）。另外，從3號膠點的酶解肽段的一級質譜圖譜中（圖4，封底）挑選信噪比> 50的母離子對其碎片進行二級質譜分析，鑒定出一個肽段，屬于鏡王蛇（Ophiophagus ha-nnah）膠原蛋白α鏈上的一個片段，得分為66，其氨基酸序列為GESGPAGPAGPAGPAGAR（圖3F，封底）。

4 討論

已有研究[2]表明，蘄蛇每克藥材含核苷類成分0.5～1mg，總磷脂13～44mg[3]，含量較低且對其藥效尚無相關報道，只能作為考察藥材質量的參考指標。《脈癥治方》[13]、《雜病廣要》[14]等古籍在用藥上特別指出用“蘄蛇肉”或“去皮骨取凈肉”，據此推測相對于皮和骨，蛇肉可能是藥效成分富集的部位。蛇類藥材以干燥全蛇入藥，總氨基酸含量很高[15]，在蛋白質水平的研究上，通過生物酶解方法來獲取活性蛋白已經取得一些進展，但對于傳統的煎煮及酒浸方法中獲取的蛋白/多肽成分的研究尚無相關的報道。

本研究引入蛋白質組學方法分析蘄蛇乙醇提取物中的肽類成分，凝膠圖像顯示在弱酸性，中性及弱堿性的等電點區間內均有多肽分布，而各區間內的多肽等電點接近，推測它們是由藥材中原始的大分子蛋白溶出后受熱分解的片段和游離氨基酸隨機重排形成，這些隨機形成的肽段由20個左右的殘基組成，分子量主要集中在2kDa區域，難以在已有的數據庫中找到匹配的序列。可能的原因包括：一是目前蛇類蛋白數據庫中的肽段序列信息還不夠全面；二是經過重排后的肽段序列與天然的片段序列發生較大變化。我們計劃通過色譜純化分離后進行Edman降解測序來進一步發現可能的活性片段。

劉端勇等[16]認為，蟲蛇類動物藥所含蛋白經過高溫煎煮后變性分解，成為無生物活性的游離氨基酸。本研究的結果表明以上觀點并不準確。對凝膠上10-15kDa范圍內的兩個多肽膠點膠內酶切后進行質譜分析和蛋白數據檢索，高置信度匹配木紋響尾蛇和東部菱背響尾蛇的α骨骼肌蛋白中的多個肽段序列，這表明蘄蛇干燥藥材中的蛋白在溶出過程中并未完全降解，除了游離氨基酸，還存在結構穩定的肽類成分。近年研究顯示，β-actins是類風濕關節炎的一類重要致病性抗原[17-18]，而actin家族成員間序列高度同源。由此推測，這些多肽片段可能與特異性抗原的耐受相關。此外還從三號凝膠點匹配到眼鏡王蛇（Ophiophagus hannah）膠原蛋白α鏈上由18個殘基組成的一個肽段。我們注意到這一片段中包含一段完整的抗原表位的核心序列GPAGTAGAR，研究顯示這一序列具有免疫原性，但無致關節炎性[19]。

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（收稿：2016-10-26修回：2016-12-04）

Proteomatic Analysis of Peptides from Qishe Ethanol Extract

LIN Chen,WEN Chengping,FAN Yongsheng TCM Clinical and Experimental Institute,Basic Medical College,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou (310053),China

ObjectiveTo investigate peptides contained within the ethanol extracts of Chinese herb Qishe（Agkistrodon acutus（Guenther））by a proteomic analysis.MethodsEthanol extracts of Qishe were produced following steps recorded in the Chinese pharmacopeia.Polypeptides within the samples were initially separated by two-dimensional electrophoresis.Valid spots were cut and trypsin-proteolysed,and were analyzed using TOF-TOF mass spectrometry,data from which were searched in the database to establish the identification.ResultsExtraction rate was 5.48%per gram crude medicine.Polypeptides separated by electrophoresis mainly distributed at 2kDa mark area, indicating their composition of 15-20 amino acids.Produced mass data from two gel spots within 10-15kDa mark area were identified in the database as fragments of skeletal alpha（α）-actin and Type I collagen.ConclusionHeating of ethanol is effective to produce extracts containing polypeptides from Qishe.

agkistrodon acutus;polypeptides;proteomics;electrophoresis;mass spectrometry

浙江中醫藥大學校級科研基金人才專項項目（No.2013ZR01）；浙江省教育廳一般科研項目（No.Y201430952）

浙江中醫藥大學基礎醫學院中醫臨床基礎研究所（杭州31 0053）

林晨，Tel：13588825780；E-mail：linchen@zcmu.edu.cn