遠端肢體缺血預處理腦保護作用機制研究進展

萬雅琦綜述， 吳世政審校

遠端肢體缺血預處理腦保護作用機制研究進展

萬雅琦1綜述， 吳世政2審校

遠端肢體缺血預處理(remote limb ischemic preconditioning，LRP，RLIP)是指通過間斷的非致死量的遠端肢體缺血刺激來誘導大腦的缺血耐受，從而在后期腦缺血事件中盡可能的保護神經元，減少神經細胞凋亡及壞死，減輕腦水腫，改善預后的一種干預措施[1～4]早在1945年時，便已經有科學家提出缺氧耐受的理論，認為在組織器官缺血、缺氧事件發(fā)生前后對機體進行一定的處理能夠調動細胞內外的應急系統(tǒng)，從而在缺血、缺氧性事件中為受損臟器提供一定的保護效應[5]，自此掀起了預處理的研究熱潮。其后又先后有科學家發(fā)現(xiàn)，某一臟器的缺血性損傷(心臟、腸、肝臟、腎臟)，降低了患其他臟器(心臟、腦等)缺血性事件的發(fā)生概率以及嚴重程度[6～8]。人們又將遠端缺血器官延伸到肢體上，從而大大減少了預處理的損傷程度，還可以通過無創(chuàng)袖帶加壓法阻斷血流等此類無創(chuàng)方式實施預處理，簡便易行。

目前國內外已經有大量有關遠端肢體缺血預處理的神經保護作用研究。而這一保護作用在臨床上也有相應的證據(jù)證明其存在，Connolly等[9]通過搜集有關病例發(fā)現(xiàn)既往患周圍血管栓塞性疾病未進行治療的患者其心腦事件發(fā)生后的功能障礙要低于經過治療的的患者，也就是說肢體的慢性缺血是能夠調動機體的保護機制激活，從而減輕腦缺血后神經系統(tǒng)的損傷。Oh等[10]通過臨床研究發(fā)現(xiàn)給擬行髖關節(jié)置換術的患者給予肢體止血帶加壓缺血預處理后，能夠大大增加術后腦區(qū)域氧飽和度及肺內氧合能力，同時還能降低血液內炎癥因子及乳酸脫氫酶水平。

1 遠端肢體缺血預處理的模型制作

動物實驗中遠端肢體缺血預處理的模型制作方式以及缺血、再灌時間各異，但主要為有創(chuàng)和無創(chuàng)兩類，又可分為雙側缺血與單側缺血兩種：

1.1 單側肢體缺血(一般選取左后肢) 無創(chuàng)RLIP 模型：用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，自制的血壓計袖袋纏住單側后肢的根部，加壓阻斷股動脈(+)：加壓后該肢體脈搏消失、體溫下降、發(fā)紺，持續(xù)5 min；減壓，脈搏出現(xiàn)、體溫回升、皮膚潮紅，為再灌注的標志，持續(xù)5 min，共3個循環(huán)[11]。這一方法的優(yōu)點是創(chuàng)傷小、大鼠的存活率高、不影響神經功能評分，缺點是缺血程度較為主觀，沒有有創(chuàng)性的夾閉股動脈可控性高，結合袖帶血壓血流測量儀可以有效改善這一缺點。

有創(chuàng)模型：分離左下肢股動脈，動脈夾夾閉15 min，恢復再灌15 min，反復3個循環(huán)[12]。該方法雖然能夠保持組內每只動物缺血程度的基本一致，卻因其創(chuàng)傷較大，影響后期存活率及神經功能缺損程度的判斷。

1.2 雙側肢體缺血 在距股動脈根部遠心端大約3 mm左右位置動脈夾夾閉雙側股動脈，進行5 min斷流，5 min再灌的循環(huán)共3次。夾閉動脈后觀察肌肉顏色變化，皮膚溫度降低，回復血流時溫度升高，皮膚變紅潤，表示造模成功[13]。同樣，該種方法為有創(chuàng)操作，相比單側而言對實驗動物的損傷更大，但雙側缺血與單側缺血相比是否預處理效果更佳，保護效應更明顯，目前尚缺乏有效的實驗數(shù)據(jù)來說明，還需要進一步驗證。

1.3 腹主動脈血流阻斷 沿大鼠腹正中切口切開，溫鹽水紗布包裹后輕輕撥開腸管，打開后腹膜，鈍性分離腹主動脈與下腔靜脈，于腹主動脈與左右髂總動脈分叉處，將一塑料軟管與血管并行放置，穿一根手術用絲線阻斷腹主動脈血流(或使用動脈夾代替以上繁瑣步驟)10 min，恢復血流10 min共重復3次[14]。

關于上下肢缺血預處理效果是否有差異，目前尚無相關研究證明。三類方法均能夠有效復制遠端肢體缺血預處理模型，實驗者可根據(jù)具體實驗室條件及實驗設計合理選擇，就目前來說，無創(chuàng)袖帶加壓法最為理想，避免了肢體損傷干擾的后期神經功能評分的準確度，但需要用到動物血壓監(jiān)測儀，肉眼判斷組織溫度及顏色變化會存在一定的人為因素干擾。直接手術動脈夾夾閉法的缺血效應最為精準，可以控制，但是由于肢體的損傷，可能會影響神經功能的判斷，因而在手術過程中要盡量減少組織損傷，手術切口盡可能小。

2 參與遠端缺血預處理的時間窗

腦缺血耐受主要分為兩個階段，早期快速缺血耐受階段(缺預處理后30～60 min)，第二階段遲發(fā)性保護作用階段(24～72 h)。因而絕大多數(shù)的研究也就圍繞在這兩個時間段進行，一般認為，超過72 h預處理的保護作用便不再明顯，可能與損傷性因素的加劇，炎癥級聯(lián)反應的出現(xiàn)有關，也可能是由于保護性因子、蛋白的耗竭或分解[15]。

3 參與遠端肢體缺血預處理神經保護作用的可能機制

目前以高致死率致殘率占據(jù)世界高危疾病前三的缺血性腦卒中是神經系統(tǒng)疾病防治工作中的重點研究對象[16]，并且有著年輕化的趨勢，不單單只是中老年高發(fā)病，一些青壯年，甚至兒童病例的發(fā)現(xiàn)也在不斷向人們敲響警鐘——腦損傷的防治研究迫在眉睫，而遠端缺血預處理是各大研究中非常有發(fā)展前景的一項。關于遠端肢體缺血預處理的可能機制，目前國際公認的有神經、體液、免疫相關途徑三條主要途徑，(1)神經因素：神經節(jié)阻斷劑能夠一定程度上降低預處理所起到的神經保護作用，在切斷大鼠雙側坐骨神經后，遠端肢體缺血預處理的神經保護作用也就不再明顯[17]。(2)體液途徑：遠端缺血預處理后，體內的某些因子通過血液循環(huán)帶到腦組織中，啟動腦缺血耐受。(3)免疫因素：預處理能夠抑制系統(tǒng)炎癥，臨床研究發(fā)現(xiàn)，基因芯片技術分析既往存在短暫性肢體缺血性疾病的志愿者血漿，促炎因子相關基因減少，抗炎因子基因增加；預處理能降低健康成年男性血液中中性粒細胞活性，減少中性粒細胞粘附至血管內皮的功能，改善外周免疫細胞功能及數(shù)目[18]。

此外，尚有三者共同起作用的共同通路學說也在遠端肢體缺氧預處理的神經保護機制中占據(jù)一席之地，該學說認為：神經因素、體液因素以及免疫因素在遠端肢體缺血預處理對腦缺血的作用并非是單一的，而是相互影響，共同起作用的，當然也不排除有其他因素的參與。這些調節(jié)都能夠引起細胞內外某些分子的數(shù)目、結構、功能以及分布的變化，從而引起相應的生物學效應。其中就包括：炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α、過氧化物、凋亡及細胞自噬相關蛋白，內皮因子。

目前參與遠端肢體缺血預處理所引起腦缺血耐受的有關分子及信號通路主要有以下幾種：

(1) 信號分子

①血管內皮生長因子：文雅惠等人[19]發(fā)現(xiàn)肢體缺血預處理減少了大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型腦組織血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血小板源性生長因子B(platelet-derived growth factor B，PDGF-B)含量，認為此保護作用與血管再生有關系。

②水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)：有學者認為，LRP能通過下調AQP4來改善神經功能[20]，但同時有相反的觀點指出LRP對DWI中梗死灶范圍的控制與AQP4的上調有關[12]。

③腦紅蛋白表達：Ran等人[21]發(fā)現(xiàn)遠端肢體預處理能夠改善復蘇后大鼠腦功能受損情況，在預處理前給予腦紅蛋白反義寡核苷酸后，腦組織內的腦紅蛋白含量下降，預處理所帶來的神經功能改善作用沒有之前明顯。

(2) 信號通路

①P38/MAPK 信號通路：RLIP 對大鼠腦損傷的保護作用可能與p38MAPK信號通路活性的降低有關，Caspase8 和Caspase3 表達降低，從而抑制神經細胞凋亡。短時間的腦組織缺血可以誘導腦組織對的缺血、缺氧的耐受性。其原因可能是較短時間內亞致死性缺血引起的腦組織內磷酸化p38的表達較晚，而再灌注數(shù)小時后表達才緩慢增強，且表達的量較少。免疫組織化學結果顯示，給予遠端肢體缺血預處理后，p38MAPK信號通路活性明顯降低，Caspase 8 蛋白和Caspse 3 蛋白表達下降，海馬CA1區(qū)神經細胞凋亡減少，提示RIPC可能通過降低p38MAPK信號通路的活性抑制神經細胞凋亡發(fā)揮腦保護作用[11]。

②Notch信號通路：預處理后Notch信號表達降低，但隨著時間變化，表達有所改變，后期對照組表達下降而預處理組表達逐漸增強[22]。

③JAK-STAT3信號通路：遠端肢體缺血預處理MCAO大鼠腦梗面積減小是通過JAK-STAT3信號通路上調Bcl-2蛋白，下調Bax蛋白，抑制細胞凋亡來實現(xiàn)的[23]。

④其他信號通路：董文帥等人[24]通過基因芯片技術檢測遠端缺血預處理大鼠腦組織半暗帶基因表達情況發(fā)現(xiàn)以下通路與遠端缺血預處理的神經保護作用有關：JAK-STAT通路、P53信號通路、MAPK信號通路、谷氨酸突觸信號通路、血管內皮生長因子信號通路等多條信號通路。

4 其它可能機制

預處理上調nNOS(神經源性一氧化氮合酶)，調動nNOs 水平升高，并且與p-ERK 密切相關，此外，血管內皮系統(tǒng)NOS的合成增加及其潛在的PI3K/Akt信號通路的激活起到神經保護作用，該酶的抑制劑能夠部分阻斷預處理所帶來的神經保護作用。遠端肢體缺血后處理也能參與到后處理的保護作用機制當中，這為預處理的機制探討提供了線索[25]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)RIPC的作用可能是通過磷酸化的mTOR 實現(xiàn)，許多研究發(fā)現(xiàn)mTOR 可調節(jié)蛋白合成，通過促進血管生成及神經再生，促進神經修復，mTOR 抑制可能導致細胞自噬或凋亡。死亡受體CD95 的刺激可活化PI3K/AKT/mTOR 信號通路，增加蛋白表達及神經干細胞存活率[26]，給遠端肢體缺血預處理的機制探討又提供了一個新的方向。但近年來也有人發(fā)現(xiàn)遠端缺血并未改變血液中細胞外超氧化物歧化酶及谷胱甘肽過氧化物酶這類腦損傷性物質的含量，一定程度上否認了預處理與抗氧化物質改變之間的關系，這也提示我們遠端缺血預處理的最終效應是有益的還是不利的，可能取決于缺血時間及程度的大小。

當前有關遠端肢體缺血預處理的效應以神經保護作用的研究結論居多，而腦損傷的核心是小膠質細胞的激活，雖然目前已經有遠端缺血后處理通過提前激活小膠質細胞誘導免疫耐受的研究，但是有關預處理通過激活小膠質細胞相關通路誘導缺血耐受的研究尚少，我們接下來可以此為切入點探索遠端缺血預處理神經保護作用的機制。由于仍然存在相當一部分觀點否認遠端缺血預處理對臟器的保護作用[27]，遠端缺血預處理與腦保護作用之間的關系到底如何，具體機制是什么，最先啟動的信號分子是哪些目前還需要大量的實驗結果來支持。

[1]Lim SY，Yellon DM，Hausenloy DJ. The neural and humoral pathways in remote limb ischemic preconditioning[J]. Basic Res Cardiol，2010，105(5)：651-655.

[2]Park UJ，Kim HT，Cho WH，et al. Remote ischemic preconditioning enhances the expression of genes encoding antioxidant enzymes and endoplasmic reticulum stress-related proteins in pat skeletal muscle[J]. Vascular Specialist International，2016，32(4)：141.

[3]Kancirová I，Jaová M，Muráriková M，et al. Cardioprotection induced by remote ischemic preconditioning preserves the mitochondrial respiratory function in acute diabetic myocardium[J]. Physiolog Res，2016，65(S5)：S611.

[4]Mudaliar H，Rayner B，Billah M，et al. Remote ischemic preconditioning attenuates EGR-1 expression following myocardial ischemia reperfusion injury through activation of the JAK-STAT pathway[J]. Inter J Cardiol，2017，228：729-741.

[5]Pace N，Consolazio WV，Lozner EL. The effect of transfusions of red blood cells on the hypoxia tolerance of normal men[J]. Science，1945，102(2658)：589-591.

[6]Abdul-Ghani S，F(xiàn)leishman AN，Khaliulin I，et al. Remote ischemic preconditioning triggers changes in autonomic nervous system activity：implications for cardioprotection[J]. Physiological Reports，2017，5(3)：e13085.

[7]Zhang Y，Zhang X，Chi D，et al. Remote ischemic preconditioning for prevention of acute kidney injury in patients undergoing on-pump cardiac surgery：a systematic review and meta-analysis[J]. Medicine，2016，95(37)：e3465.

[8]He N，Jia JJ，Li JH，et al. Remote ischemic perconditioning prevents liver transplantation-induced ischemia/reperfusion injury in rats：role of ROS/RNS and eNOS[J]. World J Gastroenterol，2017，23(5)：830.

[9]Connolly M，Bilgin-Freiert A，Ellingson B，et al. Peripheral vascular disease as remote ischemic preconditioning，for acute stroke[J]. Clinic Neurol Neurosurg，2013，115(10)：2124-2129.

[10]Oh CS，Kim SH，Lee J，et al. Impact of remote ischaemic preconditioning on cerebral oxygenation during total knee arthroplasty[J]. Inter J Med Sci，2017，14(2)：115.

[11]修麗梅，李光來，張曉敏，等. p38MAPK信號通路在肢體缺血預處理腦保護中的作用[J]. 中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2015，(9)：1637-1643.

[12]陳秋雁，吳富淋，繆紹維，等. 肢體遠端缺血預處理延緩腦卒中DWI上病灶出現(xiàn)的機制研究[J]. 中風與神經疾病雜志，2014，31(3)：247-250.

[13]徐 林，張登文，楊仕杰，等. 遠端缺血再灌注預處理對心肌細胞膜ATP敏感性鉀離子通道表達的影響[J]. 中國臨床藥理學與治療學，2015，20(4)：366-369.

[14]余 超，劉 進. 雙下肢缺血預處理經神經通路對大鼠腦局部缺血再灌注損傷的保護作用[J]. 四川大學學報(醫(yī)學版)，2014，42(2)：216-220.

[15]Meller R，Simon RP. A critical review of mechanisms regulating remote preconditioning-induced brain protection[J]. J App Physiol，2015，119(10)：1135-1142.

[16]涂雪松. 缺血性腦卒中的流行病學研究[J]. 中國臨床神經科學，2016，24(5)：594-599.

[17]余 超，劉 進. 雙下肢缺血預處理經神經通路對大鼠腦局部缺血再灌注損傷的保護作用[J]. 四川大學學報(醫(yī)學版)，2014，45(2)：216-220.

[18]Pan J，Li X，Peng Y. Remote ischemic conditioning for acute ischemic stroke：Dawn in the darkness[J]. Rev Neurosci，2016，27(5)：501-510.

[19]文雅惠，李光來，薛國芳. 肢體缺血預處理對腦缺血大鼠再灌注損傷VEGF、PDGF-B的影響[J]. 中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2013，11(6)：721-723.

[20]Li S，Hu X，Zhang M，et al. Remote ischemic post-conditioning improves neurological function by AQP4 downregulation in astrocytes[J]. Behav Brain Res，2015，289：1-8.

[21]Fanabc R，Yub T，Linb JL，et al. Remote ischemic preconditioning improves post resuscitation cerebral function via overexpressing neuroglobin after cardiac arrest in rats[J]. Brain Res，2016，1648(2)：345-355.

[22]呂文英，熊利澤，董海龍，等. Notch信號在肢體遠程預處理誘導腦保護機制研究[J]. 中華神經外科疾病研究雜志，2011，10(3)：214-217.

[23]修麗梅，李光來. JAK2-STAT3信號轉導通路在肢體缺血預處理腦保護中的作用[A]//中華醫(yī)學會、中華醫(yī)學會神經病學分會. 中華醫(yī)學會第十八次全國神經病學學術會議論文匯編(下)[C]. 中華醫(yī)學會、中華醫(yī)學會神經病學分會，2015.

[24]董文帥，金 巍，陳 靜，等. 遠隔缺血預處理誘導大鼠缺血腦保護的基因表達譜分析[J]. 中國臨床神經科學，2015，1：1-8.

[25]魯芳芳，王 偉. 遠端缺血預處理的腦保護作用機制研究進展[J]. 臨床兒科雜志，2016，34(8)：634-636.

[26]陳洪菊，唐彬秩，屈 藝，等. 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白參與神經系統(tǒng)損傷修復的研究進展及其延伸意義[J]. 中國修復重建外科雜志，2012，26(5)：625-630.

[27]Pierce B，Bole I，Patel V，et al. Clinical outcomes of remote ischemic preconditioning prior to cardiac surgery：a meta-analysis of randomized controlled trials[J]. J Am Heart Associat，2017，6(2)：e004666.

2017-01-16；

2017-03-20 作者單位：(1.青海大學醫(yī)學院，青海 西寧 810000 2.青海省人民醫(yī)院神經內科，青海 西寧 810000)

吳世政，E-mail：wushizheng2005@hotmail.com

1003-2754(2017)05-0469-03

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