紫鉚因通過自噬途徑促進骨肉瘤細胞凋亡及機制研究

蔡寧宇 潘天龍 李斌 吳登穎 潘駿

紫鉚因通過自噬途徑促進骨肉瘤細胞凋亡及機制研究

蔡寧宇 潘天龍 李斌 吳登穎 潘駿

目的研究紫鉚因對骨肉瘤細胞凋亡及自噬的影響，并探討自噬在紫鉚因抗骨肉瘤中的作用。方法分別以不同濃度紫鉚因作用骨肉瘤細胞24h和30μmol/L紫鉚因作用骨肉瘤細胞不同時間，使用CCK-8試劑盒測定細胞活性變化；Western blot法檢測凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved caspase3及自噬相關蛋白p62、LC3、Beclin-1的表達情況；TUNEL染色檢測骨肉瘤細胞的凋亡情況；透射電子顯微鏡檢測自噬泡的產生；最后分別用自噬激動劑和自噬抑制劑預處理后再加入紫鉚因作用于骨肉瘤細胞，并重復上述實驗。結果紫鉚因作用后，骨肉瘤細胞的活性明顯下降，Bax、Cleaved caspase3、Beclin-1、LC3 II的表達增加，而Bcl-2、p62的表達降低，骨肉瘤細胞出現明顯的凋亡現象，透射電子顯微鏡觀察到紫鉚因處理組有較多自噬泡產生；使用自噬抑制劑預處理骨肉瘤細胞后，紫鉚因對骨肉瘤的凋亡效果被逆轉，而使用自噬激動劑預處理骨肉瘤細胞后，紫鉚因使骨肉瘤細胞凋亡的效果進一步增強。結論紫鉚因可以降低骨肉瘤細胞活性并促進其凋亡；同時紫鉚因可以激活自噬，促進骨肉瘤細胞凋亡。

紫鉚因骨肉瘤凋亡自噬

骨肉瘤的發病率在骨骼惡性腫瘤中居首位，其惡性程度高，易發生肺轉移，進展迅速。1982年，Rosen提出新輔助化療的概念，使阿霉素、順鉑、甲氨蝶呤等藥物[1-2]廣泛應用于骨肉瘤治療，患者的5年生存率顯著提高[3-4]。然而骨肉瘤擁有易復發、易轉移的特性，患者的長期生存率并沒有進一步提高[5]。近年來，天然藥物以來源豐富、安全范圍廣、提煉成本低等優勢成為腫瘤治療領域的熱點。紫鉚因是來源廣泛的多酚類化合物，化學名2′, 3,4,4′-四羥基查爾酮（2′,3,4,4′-Tetrahydroxychalcone），具有抗腫瘤、抗血管生成、抗氧化等多種生物學活性，已在多種腫瘤細胞中（如乳腺癌[6-7]、肝癌[8-9]、肺癌[10]及黑色素瘤[11]等）展現出抗腫瘤特性，但其對骨肉瘤細胞的作用并未被明確闡明。自噬是溶酶體對受損細胞器及無功能蛋白進行消化的過程[12]，適量激活自噬可以增強腫瘤細胞應對外界刺激的能力[13]，過度激活自噬則會導致腫瘤細胞死亡，因此了解自噬激活所起的作用對腫瘤的治療至關重要。本研究探討紫鉚因對骨肉瘤細胞的抗腫瘤作用，進一步檢測其對腫瘤細胞自噬的激活作用并探討自噬的作用。

1 材料和方法

1.1 細胞和試劑骨肉瘤MG63細胞株購于中科院生命科學研究院細胞庫。紫鉚因、雷帕霉素（Rapamycin, Rapa）、6-氨基-3-甲基嘌呤（3-Methyladenine,3MA）均購于美國Sigma公司；胎牛血清、DMEM基本培養基購于美國Gibco公司；CCK-8試劑盒、BCA試劑盒購于中國碧云天公司；TUNEL試劑盒購于瑞士Roche公司；Bax、Bcl-2、Cleaved caspase3、p62、LC3、Beclin-1抗體均購于美國CST公司；β-actin抗體、山羊抗兔抗體、山羊抗鼠抗體均購于美國Bioworld公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養骨肉瘤MG63細胞使用含10%胎牛血清，1%青、鏈霉素雙抗的DMEM培養基培養于37℃、含5%CO2培養箱中。