NRF2與糖尿病心肌病發病機制的研究進展

劉雨哲,陳麗娟

(吉林大學第二醫院 心血管內科，吉林 長春130041)

NRF2與糖尿病心肌病發病機制的研究進展

劉雨哲,陳麗娟*

(吉林大學第二醫院 心血管內科，吉林 長春130041)

糖尿病心肌病(Diabetic Cardiomyopathies DCM)是糖尿病的主要并發癥，目前，因糖尿病心肌損害發生心力衰竭的比率接近30%，心力衰竭已成為糖尿病患者的主要致死及住院原因[1]，DCM的發病機制復雜，可能與高血糖水平、炎癥反應、氧化應激、血管內皮損傷及微血管病變、心肌細胞肥大及纖維化等多種因素有關，有學者認為氧化應激可能在糖尿病心肌病發病中起關鍵作用[2,3,4]，核因子 NF-E2 相關因子2 (NF-E2-Related Factor 2，Nrf2 )通過與抗氧化反應元件( antioxidant responsive element，ARE)相互作用調節抗氧化蛋白的表達，保護細胞不受到氧化應激反應的損害，Nrf2- ARE信號傳導通路是機體抗氧化應激損傷的重要機制[5]。目前關于Nrf2對糖尿病并發癥的保護作用已成為研究熱點，對Nrf2與糖尿病心肌病相互作用的研究也在顯著增多。

1 糖尿病心肌病的發病機理

1.1高血糖是糖尿病心肌病的始動因素

1.1.1糖代謝異常 當血糖水平處于較高水平時，會對心肌細胞收縮蛋白及鈣調節蛋白產生異常修飾作用，影響三羧酸循環的關鍵酶如己糖激酶、丙酮酸激酶的表達，影響葡萄糖的利用，也可通過多元醇途徑及和氨基已糖途徑造成葡糖糖、脂質及心肌能量代謝異常從而影響心肌細胞的功能進而造成形態學的改變[3，6，7]。

1.1.2增加細胞內高級糖基化終產物(Advanced glycation end products AGEs)生成 AGEs 是脂類及蛋白暴露在高糖環境下的糖基化產物，在糖尿病的脈管系統中普遍存在并促進動脈粥樣硬化的形成[8]。在糖尿病環境中，細胞內的AGEs以三種方式損害細胞，第一、細胞內的蛋白被AGEs修飾后發生了功能的改變，第二、細胞外基質的功能部位經AGEs修飾后結構異常，導致與其它功能部位或與表達在細胞表面的特殊功能部位受體發生異常結合。第三、經修飾后的血漿蛋白轉變成AGEs，并與巨噬細胞、血管平滑肌細胞及血管內皮細胞表面的AGE受體特異性結合，結合后的AGE受體可以誘導以上細胞產生活性氧(reactive oxygen species ROS)，進而激活核因子-κB(nuclear factor -κB NF-κB),導致一系列基因表達的改變。[3]

1.1.3蛋白激酶 C(proreinkinaseC，PKC)的激活

PKC是一組CAMP依賴的蛋白激酶的總稱，包含多種亞型，在多種細胞功能及信號傳導通路中起到關鍵作用[9].血糖水平升高時，可以通過線粒體過氧化誘導PKC的激活[10]。PKC的激活 可以促進纖連蛋白(fibronectin FN)和轉化生長因子β (transforming growth factor β TGF-β)等因子的過度表達，從而導致心肌肥大及纖維化的發生[11]。

1.2氧化應激是糖尿病心肌病的中樞環節

氧化應激在糖尿病血管病變中起到中樞作用，這一作用不只表現在對心血管系統的損害，同樣表現在微血管的損害。糖尿病代謝的紊亂導致血管內皮、微血管及心肌細胞內線粒體過氧化產物的堆積，從而導致細胞內ROS的增加[3]，ROS產物可以通過誘導細胞凋亡或者激活不正常的信號傳導通路導致細胞損傷，還可以直接導致細胞DNA的損傷和抑制DNA損傷修復機制的激活，從而誘導ROS介導的細胞死亡及非正常的細胞重塑，最終出現糖尿病心肌病的心臟功能及結構異常[12,13]。關于糖尿病心肌病氧化應激的信號傳導通路，一般認為通過NF-κB 、 c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinases JNK)及p-38 絲裂原活化激酶(p-38 mitogen-activated protein kinases p-38 MAPK)信號傳導通路實現。其中NF-κB是高血糖刺激及氧化應激的主要細胞內作用靶點，NF-κB在免疫、炎癥及細胞凋亡方面發揮著至關重要的作用，NF-κB信號傳導通路的改變與糖尿病及動脈粥樣硬化密切相關。JNK和p-38 MAPK是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases MAPK)家族的重要成員，MAPK是一個蛋白激酶家族，該家族可將多種細胞外刺激傳遞至細胞核，參與調解細胞增殖，分化及凋亡的過程，該家族可被多種細胞外及細胞內的應激刺激激活。JNK可被高血糖誘導的氧化應激激活，這種激活可以被抗氧化劑維生素C抑制而被血管緊張素Ⅱ增強。p-38 MAPK可被糖尿病產生的高血糖活化，并可促進其下游因子熱休克蛋白25的磷酸化，最終導致ROS產物的增多[14]。

1.3血管內皮損傷、微血管病變、心肌細胞損害及纖維化進一步推進病程

在糖尿病環境下，內皮細胞的損傷引起的冠狀動脈粥樣硬化進一步造成心臟的損害，炎癥反應在粥樣斑塊形成當中發揮中心作用，高血糖、低密度脂蛋白形成、ROS增多都可以導致炎癥細胞對內皮細胞的損傷，進而形成脂質斑塊。造成冠脈供血減少，影響心肌的供血供養[15]。此外糖尿病引起的微血管病變如毛細血管基底膜增厚，動脈內和血管周圍纖維變性，冠狀動脈間質纖維化等進一步加重心肌細胞的缺血、缺氧，導致心肌損傷的發生。由于長期慢性的缺血、缺氧心肌細胞的的凋亡和非正常死亡增加，這一過程可能與P53的糖基化有關[16,17]。正常心肌細胞的死亡后心肌成纖維細胞增生，出現心肌的纖維化，最終導致心室肥大及心功能不全。在這一過程中，血管緊張素Ⅱ及其受體的增加誘導了心肌纖維化的進展[18]。

2 Nrf2是抗氧化應激的中樞環節

2.1抗氧化應激系統與Nrf2

有機體的生存有賴于氧氣的供應，但隨著機體內線粒體的呼吸過程也產生大量的副產品，這些副產品主要以ROS的形式存在，如果機體內的活性氧不能及時的清除，極有可能出現機體功能的障礙，當活性氧與毒性物質大量堆積時，甚至可能引起細胞的死亡及機體的不可逆損傷[12]，因此機體內存在的多種抗氧化因子及解毒酶對ROS等有害物質的及時清除就顯得至關重要，機體內抗氧化的因子與解毒酶品種較多，當沒有應激反應的情況下，這些抗氧化因子與酶存在于細胞內的細胞器與基質中，當機體面臨氧化應激刺激時，各種因子與酶以網絡形式協同作用以清除細胞及間質內的ROS和毒性物質時細胞免受傷害，谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase GPx),過氧化氫酶(catalase CAT),谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase GR),NAD(P)H 醌氧化還原酶(NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 NQO1),血紅素加氧酶1(heme oxygenase1 (HO-1),還原型谷胱甘肽(reduced glutathione hormone GSH),超氧化物歧化酶( superoxide dismutase SOD),γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 ( γ-glutamylcysteine syn-thethase，γ-GCS)這些我們熟知的抗氧化因子均在這一抗氧化應激網絡中發揮重要作用，但這一抗氧化應激的網絡是否存在中心的調節點以快速有效的應對機體面對的各種氧化應激刺激呢？目前的研究表明Nrf2可能處于一系列抗氧化因子與酶類的中心[19]，當機體面對氧化應激損傷時，Nrf2的適當表達可以增強以其為中心的抗氧化因子與解毒酶的表達，快速有效地的清除體內的ROS及毒性物質使機體避免出現功能障礙及組織損傷。

2.2Nrf2-ARE信號傳導系統與Nrf2的激活

Nrf2 是cap'n collar ( CNC) 轉錄因子家族成員，該家族具有相同的高度保守的堿性亮氨酸拉鏈( leucime zipper bZIP) 結構[20]。廣泛存在于機體各個器官及組織結構當中，與ARE相互作用調節抗氧化蛋白的表達，保護細胞不受到氧化應激反應的損害，在機體不受到應激刺激的情況下，果蠅肌動蛋白結合蛋白 Kelch( Kelch-like ECH2 associated protein 1，keap1) 與Nrf2 N末端的Neh2結構域特異性結合抑制Nrf2的激活，當機體受到氧化應激刺激時，keap1與Nrf2解離，Nrf2轉移入細胞核，并與ARE結合，促進下游抗氧化因子與解毒酶的轉錄，提高機體的抗氧化應激能力。Nrf2必須與同樣具有bZIP結構的轉錄蛋白構成二聚體后才能與ARE結合，進一步激活下游的抗氧化酶系統，小maf是其中最主要的轉錄因子，在激活ARE的過程中不可或缺，Katsuoka等人分別用小鼠及成纖維細胞實驗，造成小maf的突變株及缺乏小maf 的細胞，結果顯示與小maf相關的主要的抗氧化酶受到不同程度損傷、小maf缺乏的細胞也更容易受到氧化應激損傷[21]。Nrf2小maf復合體與ARE特異性結合從而誘導下游一系列抗氧化因子及解毒酶如NAD(P)H 醌氧化還原酶(NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 NQO1),血紅素加氧酶1(heme oxygenase1 (HO-1),超氧化物歧化酶( superoxide dismutase SOD)， γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 ( γ-glutamylcysteine syn-thethase，γ-GCS)的轉錄，這一抗氧化因子的激活過程可以說明Nrf2在抗氧化應激網絡中處于中樞位置。

3 Nrf2與糖尿病心肌病的關聯性研究

3.1高血糖及氧化應激促進Nrf2的表達

Nrf2作為抗氧化應激的中心分子對糖尿病心肌病的保護作用已被多項研究證實，He X等用小鼠進行實驗發現高血糖水平可以使Nrf2野生型小鼠新生及成熟心肌細胞內產生大量ROS，同時采用濃度及時間依賴的測量方式測量Nrf2敲除小鼠心肌細胞內ROS水平，發現敲除型ROS水平明顯高于野生型，并且相對于野生型小鼠，Nrf2敲除小鼠在相對較低的血糖濃度及更少時間的高血糖刺激下即可產生嚴重的心肌細胞凋亡[22]，從而從另一個角度證明了Nrf2對于心肌細胞的保護作用，關于糖尿病如何促使Nrf2發揮作用，Zoltan Ungvari等發現以高血糖誘導體外培養的冠脈內皮細胞可以顯著提高Nrf2的轉錄活性并且促進其下游抗氧化基因NQO1,HOX-1等的表達[23]。而He M等用牛主動脈內皮細胞作為研究對象，發現AGE修飾的牛白蛋白(AGE-modified bovine albumin AGE-BSA)可以促進Nrf2向細胞核內轉移，并增強NQO1,HOX-1在mRNA及蛋白水平的表達[24]，揭示了糖尿病促進Nrf2的表達是實現對糖尿病心肌病保護作用的關鍵環節，而具體實現這一保護作用則是通過激活下游的抗氧化分子來完成。

3.2Nrf2通過對抗氧化應激網絡的調控實現對糖尿病心肌病的保護作用

目前發現的Nrf2下游基因 超過250種，其中包括抗氧化分子、Ⅱ相解毒酶，及抗炎因子等多種基因，這些因子的協同作用實現了對糖尿病心肌的保護。雖然Nrf2在糖尿病的心肌細胞中表達上調，但是否其下游基因一定會在心肌細胞中出現表達的變化呢？Zhu H等研究發現，在Nrf2敲除的小鼠心肌成纖維細胞中，過氧化氫酶(CAT),還原性谷胱甘肽(GSH),谷胱甘肽還原酶 (GR),谷胱甘肽-S-芳香基轉移酶(GSH S-transferase GST),NAD(P)H 醌氧化還原酶(NQO1)的表達明顯降低，并且Nrf2敲除的小鼠心肌細胞更容易受到氧化應激的損傷。反之用化學誘導劑誘導Nrf2+/+小鼠心肌成纖維細胞發現SOD,CAT,GSH,GR,GST,NQO1的表達明顯上升。從而證明了Nrf2通過激活下游抗氧化應激因子實現對心肌細胞的保護[25,26]。此外針對單一Nrf2下游基因對心肌細胞的保護作用的研究較多，有研究認為SOD的缺失可造成小鼠心肌纖維化及心室肥大，而同為下游基因的谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase GSHPx)的過表達則可以抑制糖尿病心肌病的心肌重塑[27,28]。由于這些研究的目標基因或因子都處在以Nrf2為中心的抗氧化應激網絡中，所以這些研究的結果也同樣指向Nrf2可能通過復雜的抗氧化應激網絡的調控實現對糖尿病心肌病的保護作用。

4 總結及展望

Nrf2作為一種處于抗氧化作用中心的轉錄因子，同時調節多種重要的抗氧化因子及二相酶、抗炎因子的表達，對糖尿病過程中的高血糖及氧化應激反應引起的器官損害起到顯著的保護作用，目前針對Nrf2對糖尿病并發癥的保護作用已成為研究熱點，此前有關抗氧化基因對糖尿病心肌病的保護作用研究較多，但尚無單一或少數幾種抗氧化基因可以阻斷或逆轉糖尿病心肌病病程的報道，糖尿病心肌病發病的分子機制復雜，涉及多種因素、多種基因，Nrf2調節的下游基因也有很多被證明在糖尿病心肌病中起到保護作用，那么通過上調Nrf2的表達是否可能是治療Nrf2的新方向呢？目前的研究多停留在基礎研究階段，有關Nrf2對糖尿病心肌病保護作用的具體機制還待進一步闡明，相信未來針對Nrf2與糖尿病心肌病治療方面的研究會進一步增多，這無疑也為糖尿病心肌病患者的康復和治療增添了多一種可能。

[1]Cohen-Solal A,Beauvais F,Loqeart D.Heart failure and diabetes mellitus:epidemiology and management of an alarming association[J].J Card Fail,2008,14:615.

[2]Khullar M,Al-Shudiefat AA,Ludke A,et al.Oxidative stress:a key contributor to diabetic cardiomyopathy[J].Can J Physiol Pharmacol,2010,88:233.

[3]Giacco F,Brownlee M.Oxidative stress and diabetic complications[J].Circ Res,2010,107:1058.

[4]Chen H,Yang X,Lu k，et al.Inhibition of high glucose-induced inflammation and fibrosis by a novel curcumin derivative prevents renal and heart injury in diabetic mice[J].Toxicol lett,2017,278:48.

[5]Nguyen T,Nioi P,Pickett CB，et al.The Nrf2-antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress[J].J Biol Chem,2009,284:13291.

[6]Mytas DZ，Stougiannos PN，Zairis MN，et al.Diabetic myocardial disease:pathophysiology，early diagnosis and therapeutic options[J].J Diabetes Com-plications，2009，23:273.

[7]Stratmann B，Gawlowski T，Tschoepe D.Diabetic cardiomyopathy-to take along story serious[J].Herz，2010，35:161.

[8]Goldin A,Beckman JA,Schmidt AM，et al.Advanced glycation end products:sparking the development of diabetic vascular injury[J].Circulation,2006,114:597.

[9]Geraldes P,King GL.Activation of protein kinase C isoforms and its impact on diabetic complications[J].Circ Res,2010,106:1319.

[10]Nishikawa T,Edelstein D,Du XL,et al.Normalizing mitochondrial superoxide production blocks three pathways of hyperglycaemic damage[J].Nature,2000,404:787.

[11]Kikkawa R,Haneda M,Uzu T,et al.Translocation of protein kinase C alpha and zeta in rat glomerular mesangial cells cultured under high glucose conditions[J].Diabetologia,1994,37:838.

[12]Boudina S,Abel ED.Diabetic cardiomyopathy revisited[J].Circulation,2007,26,115:3213

[13]Faria A,Persaud SJ.Cardiac oxidative stress in diabetes:Mechanisms and therapeutic potential[J].Pharmacol Ther,2017,172:50.

[14]Loren E WOLD,Asli F.Oxidative stress and stress signaling:menace of diabetic cardiomyopathy[J].Acta Pharmacologica Sinica,2005,26:908.

[15]O,Lorenzo B,Picatoste,S.Ares-Carrasco,et al.Potential Role of Nuclear Factor κB in Diabetic Cardiomyopathy[J].Mediators Inflamm,2011,2011,11:652.

[16]Fiordaliso F,Leri A,Cesselli D et al.Hyperglycemia activates p53 and p53-regulated genes leading tomyocyte cell death[J].Diabetes，2001，50:2363.

[17]Tate M,Grieve DJ,Ritchie RH.Are targeted therapies for diabetic cardiomyopathy on the horizon[J]?Clin Sci(Lond),2017,131(10):897.

[18]He ZH，Way KJ，Arikawa E，et al.Differential regulation of angiotensin Ⅱ induced expression of connective tissue growth factor by protein kinase C iso-forms in the myocardium[J].J Biol Chem，2005，280:15719.

[19]Singh S,Vrishni S,Singh BK,et al.Nrf2-ARE stress response mechanism:a control point in oxidative stress-mediated dysfunctions and chronic inflammatory diseases[J].Free Radic Res,2010,44:1267.

[20]Cho HY，Reddy SP，Kleeberger SR.Nrf2 defends the lung from oxidative stress[J].Antioxid Redox Signal，2006，8:76.

[21]Katsuoka F,Motohashi H,Ishii T,et al.Genetic evidence that small maf proteins are essential for the activation of antioxidant responseelement-dependent genes[J].Mol Cell Biol,2005,25:8044.

[22]He X,Kan H,Cai L,et al.Nrf2 is critical in defense against high glucose-induced oxidative damage in cardiomyocytes[J].J Mol Cell Cardiol,2009,46:47.

[23]Ungvari Z,Bailey-Downs L,Gautam T,et al.Adaptive induction of NF-E2-related factor-2-driven antioxidant genes in endothelial cells in response to hyperglycemia[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2011,300:H1133.

[24]He M,Siow RC,Sugden D,et al.Induction of HO-1 and redox signaling in endothelial cells by advanced glycation end products:a role for Nrf2 in vascular protection in diabetes[J].Nutr Metab Cardiovasc Dis,2011,21:277.

[25]Zhu H,Itoh K,Yamamoto M,et al.Role of Nrf2 signaling in regulation of antioxidants and phase 2 enzymes in cardiac fibroblasts:protection against reactive oxygen and nitrogen species-induced cell injury[J].FEBS Lett,2005,579:3029.

[26]Zhu H,Jia Z,Misra BR,et al.Nuclear factor E2-related factor 2-dependent myocardiac cytoprotection against oxidative and electrophilic stress[J].Cardiovasc Toxicol,2008,8:71.

[27]Lu Z,Xu X,Hu X,et al.Extracellular superoxide dismutase deficiency exacerbates pressure overload-induced left ventricular hypertrophy and dysfunction[J].Hypertension,2008,51:19.

[28]Matsushima S,Kinugawa S,Ide T,et al.Overexpression of glutathione peroxidase attenuates myocardial remodeling and preserves diastolic function in diabetic heart[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2006,291:H2237.

*通訊作者

1007-4287(2017)11-2037-04

2016-12-19)