線粒體與體細胞核移植

賈曉，程艷，曾溢滔

線粒體與體細胞核移植

賈曉，程艷，曾溢滔

1996 年克隆羊“Dolly”在英國誕生。此后，體細胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）技術廣泛應用于克隆動物和轉基因動物研究，迄今已有 10 多種不同物種的克隆動物相繼問世。然而，克隆效率偏低以及克隆動物表征缺陷是一直存在的問題。核質的互作與協調是所有細胞正常活動的基礎，克隆胚重編程和正常核型的維持取決于供體核與受體卵母細胞的同步協調和相互作用[1]。作為細胞能量來源的線粒體是哺乳動物細胞中唯一具有自身遺傳物質的細胞器，其正常功能的行使受到核基因組和線粒體基因組的共同調控。在核移植實驗中，卵母細胞的線粒體 DNA（mitochondria DNA，mtDNA）與供體細胞的核 DNA 能否有效地協同工作是影響核基因組重編程效率的一個重要因素。mtDNA 在不同物種之間、同一物種不同個體間均存在大量的核苷酸差異，這種由 mtDNA 多態性產生的不同mtDNA 單倍型也可導致種內核－線粒體互作產生不同效應。此外，克隆胚胎中，存在受體卵母細胞和供體細胞兩種來源的線粒體，這兩種線粒體的相互作用影響著重構胚的發育。本文對 SCNT 中線粒體的功能與特性以及兩種來源的線粒體的異質性及其對克隆效率和重構胚發育的影響進行綜述和討論。

1 SCNT 中的線粒體生物學

在哺乳動物細胞中，線粒體為細胞的生命活動提供能量。線粒體內膜有一系列酶組成傳遞電子并產生能量的結構，即呼吸鏈酶復合體，呼吸鏈產生的能量供給 ADP 與無機磷酸合成 ATP，這一過程稱為氧化磷酸化。線粒體通過呼吸鏈和氧化磷酸化的偶聯來產生并供給能量。線粒體含有自身的遺傳物質—— mtDNA。mtDNA 呈雙鏈環狀，大小約為 16.5 kb，共有 37 個編碼基因，呼吸鏈酶復合體中的 13 個蛋白質亞基由 mtDNA 編碼，而其他蛋白由核基因編碼[2]。mtDNA 和核 DNA 相互協調才能保證線粒體正常供能。

在 SCNT 中，線粒體最基本的功能是為卵母細胞的成熟和克隆胚胎的發育提供能量[3]。研究發現卵母細胞內 ATP供應不足會導致發育缺陷：如染色體分離障礙[4]、細胞分裂中斷、卵母細胞成熟失敗[5]等。在核移植操作過程中，外界的機械壓力導致細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量升高，ROS 含量過高會誘發線粒體呼吸鏈蛋白的編碼基因發生突變，從而阻斷氧化磷酸化，使線粒體不能正常供能。已有研究報道，與正常胚胎相比，克隆胚胎中H2O2和 OH-自由基的水平較高，線粒體膜電位較低[6]。膜電位是線粒體勢能儲備的指標。膜電位降低，可引起線粒體膜內外一系列的生化變化，如誘導細胞色素 C 釋放，活化caspase 蛋白酶家族，呼吸鏈與氧化磷酸化失偶聯，三磷酸腺苷合成停止，線粒體膜通透性改變，釋放凋亡誘導因子（apoptosis inducing factor，AIF）等，引起細胞凋亡的級聯反應，最終導致細胞凋亡[7]。Bae 等[8]在牛核移植操作過程中用抗氧化劑處理受體細胞和重構胚發現 H2O2水平下降，線粒體膜電位增高，克隆胚的損傷減少，保證了后續胚胎發育的正常進行。克隆胚胎中損傷線粒體的增多會導致胎盤凋亡以及凋亡基因 BCL2 和 BAX 的異常表達[9]。因此，SCNT 中線粒體結構和功能的完整性至關重要。

2 SCNT 中線粒體與供體核相容性的研究

核質的互作與協調是細胞正常活動的基礎，體細胞核移植重構胚正常核型的維持和核基因組重編程的完成，同樣取決于供體核與受體卵母細胞的同步協調和相互作用。核質互作是一個復雜的生物過程，與兩者的功能狀態及其相互作用是否符合細胞的發育規律有關，涉及供核細胞的類型、所處的細胞周期以及卵母細胞的成熟質量和處理方式等多個因素。研究發現使用卵胞質抽提物預處理供體細胞可以顯著提高核移植胚胎囊胚率，推測卵胞質抽提物改變了供體核的結構，增加了供體核與卵胞質中重編程因子的相互協調作用使得受體卵母細胞更容易重編程供體核[10]。Enright 等[11]用一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑古曲霉素 A（TSA）處理供體細胞，發現 TSA 可增加供體核的組蛋白乙酰化水平，促進發育相關基因的表達，提高克隆囊胚率。

線粒體作為哺乳動物細胞中唯一具有自身遺傳物質的細胞器，不僅參與能量供應，而且可以通過 mtDNA 合成自身功能相關的部分蛋白質，同時又受到核的調控，參與線粒體合成及功能行使的蛋白質中，大約有 1500 種由核基因編碼[12]。線粒體正常功能的行使受到核基因組和線粒體基因組的共同調控，是研究核質互作的良好材料。已有研究指出線粒體與核編碼產物不相容性可能是異種體細胞核移植失敗的重要原因。在異種體細胞核移植中，羊、猴、豬和大鼠的體細胞移植到去核牛卵母細胞中，經融合后可以支持重構胚的早期發育，但是移植到代孕動物后不能著床[13]。很可能因為早期重構胚中母源性線粒體可以暫時獨立供應ATP，而在稍后的發育階段，不同物種的核基因組與 mtDNA不能很好地兼容，核基因組無法指導母源性 mtDNA 復制和轉錄，組裝新的氧化磷酸化復合物和合成 ATP，從而導致發育失敗。因此，供體核和受體卵胞質的相容性對于核正確重編程和克隆胚的發育至關重要。

mtDNA 處于高氧壞境，并且缺乏 DNA 損傷修復機制，因此其突變率遠高于基因組 DNA[14]。這種高突變率導致不同種群之間，以及同一種群的不同個體之間的 mtDNA存在多態性位點。根據 mtDNA 的多態性位點可將其劃分為不同的單倍型。單倍型是指使用特定限制性內切酶酶切特定 DNA 片段后產生的特定酶切片段格局。mtDNA 單倍型的不同，反映 mtDNA 基因組的差異，不僅能引起生物性狀包括體重、耗氧量、ATP 含量、卵子質量、產奶量及生育能力[15]等差異，還會影響體外胚胎生產（IVP）的效率[16]，以及體細胞核移植（SCNT）的效率[17]。

據此，我們團隊應用 PCR-RFLP 技術分析牛 mtDNA的多態性，建立了線粒體分型標準，將牛群區分成 4 種主要的單倍型[17]。我們通過活體采卵（oocyte pick up，OPU）技術，獲得單倍型確定的牛卵母細胞，用作受體細胞進行體細胞核移植實驗，結果發現不同單倍型的卵母細胞具有不同的發育潛能，并影響克隆的效率。當采用 A 型卵母細胞作核移植的受體細胞時，其融合率和囊胚率均顯著高于使用B 型卵母細胞[17]。進一步研究發現 A 型線粒體單倍型的牛卵母細胞中 mtDNA 拷貝數和 ATP 的含量以及 mtDNA編碼基因的表達水平均明顯高于 B 型單倍型的卵母細胞，這可能就是產生上述不同克隆效果的原因[17]。

在體細胞核移植實驗中，供體細胞核與卵母細胞來自同一個體的，稱之為“同體克隆”；而兩者來自不同個體的，稱之為“異體克隆”[18]。我們早期的研究發現同體克隆的效率要明顯高于異體克隆，尤其是在 8 細胞以后的發育階段，同體克隆的囊胚率（38%）明顯高于異體克隆（22%）[18]。分析“同體克隆”和“異體克隆”兩者的區別：前者的供體細胞和卵母細胞的線粒體單倍型是相同的，或者說是相容的，而后者就不一定相同或相容。為了進一步研究在核移植中供體細胞與卵母細胞線粒體的相容性對克隆效率的影響，我們按照牛卵母細胞和供核細胞的單倍型來配型進行核移植試驗，結果發現同型組（卵母細胞和供體細胞的線粒體單倍型相同，即 A-A 或 B-B）的克隆效率，包括囊胚率、懷孕率和活產率均明顯高于異型組（A-B 或 B-A）。實驗結果還表明，同型克隆組重構胚中的表觀遺傳修飾，包括組蛋白H3K9 甲基化模式以及重要的胚胎發育相關基因 Oct4、Nanog 和 Sox2 的啟動子的甲基化，更接近于正常胚胎發育的水平[19]。

此外，在牛同種內（荷斯坦奶牛或魯西黃牛）核移植實驗中，觀察到上述的線粒體單倍型和配型對克隆效率的影響，在亞種間（荷斯坦牛與黃牛之間）核移植中也同樣觀察到[20]。以上結果說明，卵母細胞與供體細胞線粒體的相容性一方面促進供體細胞核的重編程，另一方面讓供體核編碼的線粒體相關蛋白及調控因子能夠更好地參與卵母細胞胞質中線粒體的組成和調控，從而更好地支持重構胚的發育。

3 SCNT 重構胚中線粒體異質性的研究

哺乳動物通過受精獲得的正常胚胎中線粒體具有同質性，即只有卵母細胞來源的線粒體，而精子線粒體在進入卵母細胞之前被一種蛋白水解肽-泛素標記，進入卵母細胞后被卵母細胞中的泛素蛋白酶系統識別并降解[21]。然而，也有報道在小鼠[22]和人類[23]等多個物種中也存在精子線粒體滲漏事件，若后代中精卵兩種線粒體的單倍型不同便會造成線粒體的異質性，可能導致自發或選擇性流產。

和正常受精產生的胚胎不同，克隆胚胎是通過核移植操作獲得的。哺乳動物體細胞核移植主要有兩種操作方法：一種是胞質內注射，即將供體核連帶部分細胞質注入去核卵母細胞胞質中；另一種是透明帶下注射，即將供體細胞直接注入去核卵母細胞的透明帶下。無論采用哪種操作方法都不可避免地會將供體細胞的線粒體帶入受體卵胞質中，從而使重構胚中存在兩種來源的線粒體，導致克隆后代中全部細胞或部分細胞同時存在兩種來源的線粒體，形成線粒體異質性[24]。

克隆胚中線粒體的異質性程度與核移植實驗的操作方法、供體細胞類型、供體細胞與受體卵母細胞的親緣關系等多種因素有關。從已有的研究報道來看，在同種內的核移植中，大多后代的線粒體主要來源于核受體[25-27]。這可能由于供體細胞與受體卵母細胞在遺傳上親緣關系較近，核基因編碼線粒體復制、轉錄和翻譯的因子能有效地支持受體卵母細胞來源的線粒體的發育，核供體來源的線粒體則經類似泛素化途徑得到降解。而在遠緣異種核移植的研究中存在兩種不同的結果。Lanza 等[28]和 Loi 等[29]分別通過異種核移植獲得了 3 頭克隆野牛和 1 頭克隆盤羊，在 3 頭克隆野牛的11 種不同組織以及盤羊的血液中均只檢測到受體卵母細胞來源的線粒體。我國科學家陳大元等在大熊貓與兔子的異種核移植研究中得到相反的結果。他們將大熊貓的體細胞移入去核兔卵母細胞中，采用大熊貓和兔線粒體 D-LOOP 區特異的引物擴增植入前囊胚和妊娠后胎兒中的 mtDNA，結果顯示克隆囊胚中大熊貓及兔來源的線粒體共存，而著床后的胎兒中線粒體主要來源于供體大熊貓[30]。這可能由于早期的胚胎編碼線粒體復制、轉錄、翻譯的因子也同時表達；而隨著胚胎發育，當核供體與核受體在遺傳上親緣關系較遠，核基因編碼的因子只能支持核供體來源的線粒體的發育。

不管造成克隆胚線粒體異質性的原因如何，已有的資料表明，克隆胚中線粒體的異質性可能是克隆效率低下，克隆胚胎流產率高，后代存活率低的重要原因之一。Lee 等[31]用綿羊成纖維細胞作為供核細胞，培養到第四代時，在細胞培養液中添加 50 ng/ml 的溴化乙錠去除 mtDNA，待供核細胞培養到第十代，mtDNA 的含量下降至初始含量的1.05%。以此細胞作為核移植的供核細胞獲得的 SCNT 胚胎中只有受體卵母細胞 mtDNA，克隆后代存活率顯著提高。這也很好地解釋了為什么同體克隆效率明顯高于異體克隆。

4 結語

細胞核移植技術具有重大的理論意義和實際價值，它不但是研究探索動物發育規律的一種重要技術手段，同時也已廣泛應用到農牧和生物醫藥的各個領域。然而，體細胞核移植目前還存在不少問題，如核移植成功的總體效率仍較低、核移植的胚胎流產率仍然較高以及胚胎發育異常如“巨胎癥”等問題。克隆胚胎的發育依賴于供體核和受體卵母細胞的相互作用，近年來的研究表明線粒體在體細胞核移植中發揮重要的作用，線粒體基因組的多態性，核基因組與線粒體基因組相容性以及重構胚中線粒體的異質性對克隆效率及克隆后代發育有重要影響。細胞核移植技術應用廣泛，如在保護瀕危物種、繁育優良畜種以及轉基因動物制藥等；另外，在醫療衛生領域，核移植技術使干細胞和組織工程在疾病治療中的應用展現出廣闊的前景。相信隨著相關研究的不斷深入，科學家們將進一步揭示核質互作的分子機制，有效地提高克隆的效率，讓克隆技術更好地應用于醫、藥、農、研等多個領域。

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“兒童安全用藥促進計劃”項目啟動

“兒童安全用藥促進計劃”由藥品安全合作聯盟（PSM）、北京藥盾公益基金會共同主辦，通過開展兒童安全用藥關鍵技術研究，對臨床醫務工作者進行兒童安全用藥相關技能培訓，廣泛開展兒童安全用藥知識的宣傳和普及活動，促進我國兒童用藥安全，提升公眾安全用藥科學素質，為“藥品安全”規劃和“健康中國”戰略服務。2016 年該項目納入國家食品藥品監督管理總局“全國安全用藥月”活動。

2017 年，項目繼續分為兩個組（研究組和活動組）實施。研究組由北京兒童醫院牽頭，攜同有關專家設立“中國兒童家庭用藥科普干預研究”課題；活動組由 PSM 五個地區志愿者團隊牽頭走進 50 家幼兒園，開展“安全用藥 娃娃抓起”科普宣傳活動，活動以專家講座的形式進行兒童安全用藥科學知識普及。向幼兒家長發放《中國兒童家庭用藥情況調研問卷》進行兒童用藥情況調查。并向活動幼兒園贈送安全用藥科普圖書《媽咪藥師談兒童合理用藥》，對幼兒園老師和家長進行用藥指導，以增強安全用藥意識。我會是 PSM 的副理事長單位，作為管理辦公室負責項目的日常管理工作。

北京醫學檢驗學會于2017年4月27日在北京成立

北京醫學檢驗學會是由北京市民政局批準成立的具有非企業獨立法人資格的學術團體，于 2017年 4 月 27 日在北京成立。學會的宗旨為“提高首都檢驗檢測能力，搭建多學科交流平臺”。該學會是由首都醫科大學附屬北京天壇醫院、解放軍總醫院、北京協和醫院、北京廣安門醫院、中國藥品生物制品檢定研究院、中國出入境檢驗檢疫科學研究院等單位專家共同發起成立，由首都醫科大學附屬北京天壇醫院檢驗科康熙雄教授任首屆會長。

隨著表觀遺傳學、基因工程與蛋白工程等新技術的發展，對檢驗醫學提出了更高、更迫切的要求，學會初期擬下設八個分委會：醫學實驗室與診斷產品質量管理專業委員會；生物組學專業委員會；測試評價專業委員會；生物化學免疫專業委員會；微生物與感染專業委員會；體液和血液學檢驗專業委員會；體外診斷系統工程技術專業委員會；臨床輸血專業委員會。根據國內醫學檢驗工作中存在的問題與實際需要將陸續成立相關的分委會，共同推動各專業領域的發展。

學會將以北京為中心，輻射京津冀開展學術交流；以學會為單位申報各類科研項目，協調開展多中心科學研究；加強科普宣傳教育和義診等公益活動，推動京津冀檢驗醫學的學科發展。

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.03.011

中國工程院咨詢研究項目（2016XY36）

200040 上海交通大學附屬兒童醫院/上海市兒童醫院/上海交通大學醫學遺傳研究所/衛生部醫學胚胎與分子生物學重點實驗室/上海市胚胎與生殖工程重點實驗室

曾溢滔，Email：ytzeng@stn.sh.cn

2017-04-11