補陽還五湯對去勢腦缺血雌性大鼠海馬神經(jīng)干細胞增殖及ERK/CREB信號通路的影響

黃昕，周勝強，劉勝賢，張必超，薛科輝，劉柏炎，*

（1.益陽醫(yī)學高等專科學校附屬醫(yī)院，湖南益陽413000；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南長沙410208）

補陽還五湯對去勢腦缺血雌性大鼠海馬神經(jīng)干細胞增殖及ERK/CREB信號通路的影響

黃昕1，周勝強2，劉勝賢1，張必超1，薛科輝1，劉柏炎1，2*

（1.益陽醫(yī)學高等專科學校附屬醫(yī)院，湖南益陽413000；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南長沙410208）

目的探討補陽還五湯對去勢腦缺血雌性大鼠海馬神經(jīng)干細胞（neural stem cells,NSCs）增殖及ERK/CREB信號通路的影響。方法采用雙側卵巢切除術(OVX)結合大腦中動脈阻塞（MCAO)法復制去勢雌性大鼠腦缺血復合模型，將造模后的36只大鼠隨機分為雙假手術組、復合模型組、雌激素組、雌激素+G15組、補陽還五湯組及補陽還五湯+G15組6組，每組6只，術后24 h給予相應藥物灌胃連續(xù)干預14 d，同時每天腹腔注射BrdU、G15分別標記增殖細胞和阻斷GPER-1。采用免疫熒光BrdU/Nestin雙標法檢測各組大鼠缺血側海馬齒狀回NSCs增殖情況，免疫組化SP法檢測ERK1/2、CREB1磷酸化蛋白表達水平。結果補陽還五湯組和雌激素組缺血側海馬DG區(qū)BrdU/Nestin雙標陽性細胞及pERK1/2、pCREB1陽性細胞表達均增加，與復合模型組比較有顯著性差異(P＜0.05），但補陽還五湯組要多于雌激素組(P＜0.05)。與補陽還五湯組比較，補陽還五湯+G15組缺血側海馬DG區(qū)BrdU/Nestin雙標陽性細胞及及pERK1/2、pCREB1陽性細胞表達均減少（P＜0.05）。結論補陽還五湯可以促進去勢腦缺血雌性大鼠缺血側海馬DG區(qū)神經(jīng)干細胞增殖，激活ERK/CREB信號通路，可能是其發(fā)揮類雌激素作用、促進內(nèi)源性神經(jīng)再生作用機制之一。

腦缺血；神經(jīng)干細胞；ERK/CREB信號通路；去勢大鼠；補陽還五湯

缺血性腦卒中是一種發(fā)病率、致死率和致殘率均極高的腦血管疾病，雖然目前診治技術不斷提高，但尚無有效治療手段[1]。神經(jīng)流行病學研究結果表明，絕經(jīng)前期婦女缺血性卒中的發(fā)病率及其嚴重程度遠低于相應年齡段的男性，而絕經(jīng)期后女性卒中發(fā)病率明顯增高并且預后較差，女性絕經(jīng)期后雌激素水平的下降與心腦血管病的發(fā)生有密切關系，故有學者提出雌激素在腦缺血中起著十分重要的作用[2]。

細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular-signa1regulated kinase,ERK)/cAMP反應元件結合蛋白（cAMP responsive element binding protein,CREB）信號通路是所有真核細胞內(nèi)將細胞外信號傳導至細胞核引起增殖、分化等作用的共同信號途徑[3]。越來越多的證據(jù)支持，除經(jīng)典核內(nèi)雌激素受體介導雌二醇（estrogen-2,E2）直接發(fā)揮基因效應外，該通路在神經(jīng)系統(tǒng)中核外雌激素受體（estrogen receptor,ER）[如G蛋白偶聯(lián)受體30(G protein-coupled receptor 30, GPR30)/G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1（G protein-coupled estrogen receptor 1,GPER-1)]介導的神經(jīng)保護、神經(jīng)再生等生物學效應中發(fā)揮重要作用[4]。

補陽還五湯是治療缺血性腦卒中后遺癥的經(jīng)典方，有較好的臨床療效。但其是如何促進缺血后神經(jīng)再生，恢復受損的神經(jīng)功能，作用機制目前尚不完全清楚[5]。

課題組前期研究證實，補陽還五湯能夠減少腦缺血大鼠腦梗死體積、促進神經(jīng)功能恢復，上調(diào)血清E2、腦組織E2及ER水平，具有類雌激素作用[6]。因此，本研究擬以雌性去勢腦缺血復合模型大鼠為研究對象，旨在深入探討補陽還五湯對缺血海馬內(nèi)源性神經(jīng)干細胞（neural stem cells,NSCs）增殖及ERK/CREB信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級SD大鼠45只，♀，體質(zhì)量（220±20）g，月齡2～3月，購自湖南斯菜克景達實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2009-0004；合格證號：004535。室溫控制在（24±0.5）℃，自由飲食進水，晝夜光照節(jié)律，適應性喂養(yǎng)1周后用于實驗。

1.2 藥物

補陽還五湯（《醫(yī)林改錯》）：黃芪120 g，歸尾6 g，赤芍4.5 g，桃仁3 g，紅花3 g，地龍3 g，川芎3 g，飲片購自湖南益陽醫(yī)學高等專科學校附屬醫(yī)院，煎藥濃縮成生藥濃度為2.6 g/mL；戊酸雌二醇片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，1 mg/粒），研磨細粉后加入蒸餾水制成濃度為100 μg/mL的混懸液；GPER-1特異性阻斷劑G15 (Chemicon公司)：用DMSO和生理鹽水稀釋成50 μg/mL的溶液（DMSO的終濃度為1 mmol/L）；BrdU（Sigma公司）：用DMSO和生理鹽水稀釋成20 mg/mL的溶液（DMSO的終濃度為1 mmol/L）的溶液。上述3種藥物配制好后均于4℃冰箱避光冷藏備用。

1.3 主要試劑及儀器

通用型SP免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：K156919F）；Rabbit Antiphospho-ERK1(Thr202/Tyr204)+ERK2(Thr183/ Tyr185)antibody（北京博奧森生物技術有限公司)；Rabbit Anti-phospho-CREB-1Rabbit Anti-phospho-CREB-1(Ser133)antibody（北京博奧森生物技術有限公司)大鼠抗BrdU單克隆抗體（Abcam公司）；兔抗Nestin單克隆抗體(Abcam公司)；Goat Anti-Rabbit IgG-FITC（Santa Cruz Biotech公司）；Texas Red-conjugated AffiniPure GoatAnti-Rat IgG+IgM（H+L）（Jackson公司）；進口羊血清工作液（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：WP150926)；2、3、5一氯化三苯四氮哇(2,3,5-chloride Triphenyltin tetrazolylazo,TTC)(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20140825)；DAB染色液（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：K152317J）；DAPI染色液（武漢博士德生物工程有限公司）；大鼠雌二醇ELISA試劑盒（上海勁馬實驗設備有限公司，批號：Wk30608）。硅膠包被線栓（規(guī)格：L3200，廣州佳靈生物技術有限公司）；生物組織自動脫水機（湖北孝感市亞光醫(yī)用電子技術公司，型號：ZT-12M）；石蠟包埋機（德國LEICA儀器公司，型號：EG1150H）；石蠟切片機（德國LEICA儀器公司，型號：RM2235）；攤片機（德國LEICA儀器公司，型號：HI1220）；倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號：BX43）；臺式高速冷凍離心機（德國HERMLE公司，型號：Z32HK）；全自動酶標儀（芬蘭Labsystems公司，型號：MK-3）。

1.4 復合模型的制備及評價

采用雙側卵巢切除術(ovariectomy,OVX)制備雌激素缺乏去勢模型大鼠，在此基礎上采用大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)法復制局灶性腦缺血模型，制成去勢雌性局灶性腦缺血大鼠復合模型。

參照Zeynalov等[7]采用OVX術復制去勢雌性大鼠模型。10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉后，腹位固定，腋下2 cm處剪毛備皮，75%酒精消毒，依次剪開皮膚、肌層及腹膜，用鑷子深入切口處拽出卵巢切除，手術縫線結扎止血(假手術組的大鼠不摘除卵巢，僅在卵巢與輸卵管連接處夾一下)，縫合切口。如法摘除另一側的卵巢。從第五天開始隨機選取6只大鼠斷尾取血，隔天1次，ELISA法檢測血清E2水平，含量低于5.0 pg/mL則確定為去勢造模成功。15 d后將去勢組所有動物再行MCAO術。

參照Longa等[8]MCAO法進行改良復制局灶性腦缺血大鼠模型。10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉后，將大鼠固定于手術操作臺上，取頸部正中切口，游離右側頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈。結扎頸總動脈、頸外動脈。于頸總動脈分叉部下方0.2-0.3 cm處剪一小口，將直徑為0.32 mm的線栓插入頸內(nèi)動脈，插入深度由分叉部計為約(18.0± 0.5)mm,固定線栓，依次關閉切口(假手術組僅切開皮膚、分離右側頸總動脈后即縫合)。動物于清醒后2 h參照文獻[8]進行神經(jīng)功能評分，分值在1～3分者入組，死亡等原因剔除的動物予以隨機替補。

1.5 分組與給藥

將30只復合造模成功的雌性大鼠隨機分為5組，每組6只:復合模型組、補陽還五湯組、雌激素組、補陽還五湯+G15組、雌激素+G15組。雙假手術組6只。總共6組。

術后24 h各組給予相對應的藥物干預：補陽還五湯組及補陽還五湯+G15組給予劑量為12.8 g/（kg·d）補陽還五湯灌胃，1.0 mL/只，每日1次；雌激素組及雌激素+G15組給予500 μg/（kg·d）戊酸雌二醇灌胃（70 kg成人臨床等效劑量），1.0 mL/只,每日1次;復合模型組及雙假手術組動物均給予等體積蒸餾水灌胃。連續(xù)給藥14 d。所有組大鼠術后第一天起按100 mg/（kg·d）劑量腹腔注射Brdu[9]，1.0 mL/（只·d），連續(xù)注射14 d，標記增殖細胞。補陽還五湯+G15及雌激素+G15組按50 μg/（kg·d）劑量腹腔注射GPER-1特異性阻斷劑G15[10]，1.0 mL/（只·d），連續(xù)14 d。雙假手術組、復合模型組、補陽還五湯組、雌激素組每日均補足等量的載體液（生理鹽水與1 mmol/L的DMSO）腹腔注射。

1.6 血清雌二醇ELISA檢測

血清雌二醇水平采用ELISA法檢測，具體過程嚴格按照試劑盒標準流程操作。

1.7 取材

各組大鼠在灌胃后第14天，末次灌胃及腹腔注射后4 h，各組大鼠用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，打開胸腔并暴露心臟，用注射用針頭經(jīng)心尖插入至主動脈端并固定好，剪開右心耳同時夾閉腹主動脈，用生理鹽水約100 mL通過注射器快速滴入，待心臟無血污流出及前爪、肺部顏色也變白后，改用4%多聚甲醛約100 mL灌注，速度先快后慢，固定好后開顱取腦，去除小腦、嗅球和腦干只保留大腦組織，置于4%多聚甲醛中固定，4℃冰箱保存用于免疫組化及免疫熒光雙標檢測。

1.8 指標檢測

1.8.1 免疫熒光雙標法檢測缺血側海馬DG區(qū)神經(jīng)干細胞增殖情況常規(guī)組織脫水、透明、浸蠟、包埋、4 μm連續(xù)冠狀切片，65℃烤片2 h后常規(guī)脫蠟至水，檸檬酸鹽高溫高壓修復10 min，2 mol/L的HCl 37.0℃孵育30 min，0.1 mol/L硼酸漂洗10 min，5%羊血清封閉內(nèi)滴加100 μL正常山羊血清室溫封閉30 min，甩去不洗，同時加入大鼠抗BrdU單克隆抗體（1∶100）、兔抗Nestin單克隆抗體(1∶100)各50 μL，4℃冰箱孵育過夜，室溫復溫30 min，PBS洗5 min×3次，滴加Goat Anti-Rabbit IgG-FITC（1∶100）和Texas Red-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rat IgG+IgM（H+L）（1∶100）熒光標記二抗各50 μL，室溫避光孵育1 h，PBS洗5 min×3次，滴加DAPI染色液50 μL，室溫避光孵育10 min，PBS洗5 min×3次，20 μL甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。同時用PBS代替一抗作空白對照以檢查免疫反應的特異性。每只動物隨機取5張切片，每張切片高倍鏡視野(×400)觀察左側海馬齒狀回(dentate gyrus, DG)，用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算單位面積陽性細胞數(shù)，取其平均值作為該組神經(jīng)干細胞增殖水平。

1.8.2 免疫組化法檢測大鼠缺血側海馬DG區(qū)pERK1/2、pCREB1蛋白的表達嚴格按照通用型SP試劑盒標準流程操作。每只動物隨機取5張切片，每張切片高倍鏡視野(×400)觀察左側海馬DG區(qū)，用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算單位面積陽性細胞數(shù)，取其平均值作為該組pERK1/2、pCREB1蛋白表達水平。

1.9 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件及Graph Pad Prism 5作圖軟件進行處理分析。計量資料用“±s”表示，組間比較，用單因素方差分析（One-way ANOVA）。分析前，先進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，滿足條件者用方差分析，方差分析有統(tǒng)計學意義者，再進行兩兩比較，兩兩比較方差齊者用SNIP法，方差不齊者用Tambane's T2法。當資料不符合正態(tài)分布時，采用多個獨立樣本比較的秩和檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義標準。

2 結果

2.1 復合模型判斷

OVX術后，ELISA結果見去勢組大鼠血清雌二醇水平隨著時間的推移不斷降低，術后第1天至術后第9天由（64.5±3）pg/mL下降至（4.1±0.5）pg/mL，小于5.0 pg/mL；假手術組大鼠血清雌二醇在（63.5±4）pg/mL范圍內(nèi)波動。說明去勢造模成功（見圖1）。且45只大鼠MCAO術后24 h，4只死亡，5只無明顯神經(jīng)功能缺損癥狀，36只均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損，評分在1～3分之間，故納入研究。說明有36只大鼠去勢局灶性腦缺血復合模型造模成功。

圖1 OVX術后假手術與去勢組大鼠血清雌二醇隨時間變化情況（n=6，±s）

2.2 補陽還五湯對大鼠缺血側海馬DG區(qū)NSCs增殖的影響

各組大鼠缺血側海馬DG區(qū)免疫熒光結果顯示：胞核呈紅色熒光者為BrdU陽性細胞（增殖細胞），胞漿呈綠色熒光者為Nestin陽性細胞（NSCs），胞核呈藍色熒光者為細胞核，Merge后呈枯黃色者為BrdU和Nestin雙標陽性細胞（即增殖的NSCs）（見圖2）。雙假手術組海馬DG區(qū)BrdU、Nestin陽性細胞少量分布，表達較弱，無雙標陽性細胞；復合模型組可見少量雙標陽性細胞。補陽還五湯組和雌激素組模型組雙標陽性細胞均增加，與復合模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）（圖2C、D），而補陽還五湯組要多于雌激素組(P＜0.05)。與雌激素組、補陽還五湯組分別比較，雌激素+G15組雙標陽性細胞、補陽還五湯+ G15組雙標陽性細胞均減少（P＜0.05）（見圖2、表1）。

圖2 各組大鼠缺血側海馬DG區(qū)NSCs增殖情況[免疫熒光BrdU(紅)/Nestin（綠）雙標，×400]

表1 補陽還五湯對大鼠缺血側海馬DG區(qū)NSCs增殖的影響（n=6，±s,個/mm2）

表1 補陽還五湯對大鼠缺血側海馬DG區(qū)NSCs增殖的影響（n=6，±s,個/mm2）

注：與復合模型組比較，*P＜0.05；與雌激素組比較，▲P＜0.05；與補陽還五湯組比較，△P＜0.05。

組別雙假手術組復合模型組雌激素組補陽還五湯組雌激素+G15組補陽還五湯+G15組F值BrdU陽性細胞數(shù)3.62±0.91 6.93±1.83 14.82±4.21 25.21±4.60 7.89±1.43 14.32±2.54 -Nestin陽性細胞數(shù)2.96±0.51 5.12±1.51 15.41±3.16 26.76±4.87 8.54±1.26 15.57±2.31 -雙標陽性細胞數(shù)2.50±0.21 4.36±0.62 11.62±2.78* 23.53±3.28*▲6.80±1.31▲13.34±1.76△32.16

2.3 補陽還五湯對大鼠缺血側海馬DG區(qū)pERK1/ 2、pCREB1蛋白表達的影響

各組大鼠缺血側海馬DG區(qū)免疫組化結果顯示：pERK1/2表達主要位于細胞漿，pCREB 1表達主要位于細胞核，陽性細胞呈棕黃色或棕褐色（見圖3）；雙假手術組右側海馬DG區(qū)可見pERK1/2、pCREB 1一定量表達；復合模型組pERK1/2、pCREB 1表達稍增加。與復合模型組比較，補陽還五湯組和雌激素組pERK1/2、pCREB 1陽性細胞均增加，且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05），但補陽還五湯組要多于雌激素組(P＜0.05)。與雌激素組、補陽還五湯組分別比較，雌激素+ G15組、補陽還五湯+G15組pERK1/2、pCREB1陽性細胞均減少（P＜0.05）（見圖3、表2）。

圖3 各組大鼠缺血側海馬DG區(qū)pERK1/2、pCREB1蛋白表達水平光鏡圖（免疫組化SP法，×400）

表2 補陽還五湯對大鼠缺血側海馬DG區(qū)pERK1/2、pCREB 1蛋白表達的影響（n=6，±s,個/mm2）

表2 補陽還五湯對大鼠缺血側海馬DG區(qū)pERK1/2、pCREB 1蛋白表達的影響（n=6，±s,個/mm2）

注：與復合模型組比較，*P＜0.05；與雌激素組比較，▲P＜0.05；與補陽還五湯組比較，△P＜0.05。

組別雙假手術組復合模型組雌激素組補陽還五湯組雌激素+G15組補陽還五湯+G15組F值pERK1/2陽性細胞數(shù)224.31±13.42 243.42±23.76 463.90±45.82* 571.97±47.93*▲276.19±21.68▲284.29±27.96△65.40 pCREB 1陽性細胞數(shù)187.36±12.89 198.32±14.90 248.92±15.76* 289.46±29.13*▲212.14±16.80▲233.52±21.91△52.21

3 討論

OVX術可以有效消除雌性動物體內(nèi)雌激素對外源性雌激素及其類似物對其干預效應的影響；MCAO法是目前國際公認的模擬人類缺血性腦卒中的經(jīng)典局灶性腦缺血造模方法。本實驗在雌性大鼠成功去勢的基礎上采用改良的Longa線栓法造模，發(fā)現(xiàn)缺血后2 h大鼠均有不同程度的神經(jīng)功能缺損，變異小，模型穩(wěn)定可靠。OVX術結合MCAO法成功復制了去勢雌性大鼠局灶性腦缺血復合模型。

既往研究表明在缺血腦組織中，雌激素具有神經(jīng)保護、神經(jīng)營養(yǎng)和促神經(jīng)再生作用，應用雌激素替代治療可使腦梗死體積明顯縮小，組織病理損害的嚴重程度亦明顯減輕，分子機制主要與激活核受體ERα與ERβ誘導的慢速基因組效應相關[11]。新近研究發(fā)現(xiàn)一種新型膜性雌激素受體GPR30/GPER-1，同時參與介導了雌激素快速非基因組效應及基因組效應。GPER-1與雌激素結合后被激活，活化與其相偶聯(lián)的G蛋白，使Gαβγ異三聚體解離成Gα和Gβγ，快速激活細胞內(nèi)的第二信號系統(tǒng)包括ERK1/ 2/CREB1的激活、鈣離子動員等，并間接調(diào)節(jié)一系列相關基因轉錄，從而影響細胞的增殖、分化、存活及凋亡[12]。Jover-Mengual等[13]報道ERK1/2、CREB1在腦缺血損傷大鼠雌激素神經(jīng)保護作用中扮演關鍵角色。本研究發(fā)現(xiàn)去勢腦缺血雌性大鼠灌服雌二醇后，ERK/CREB通路亦被激活，且右側海馬DG區(qū)NSCs增殖增加。

目前，尚沒有足夠的證據(jù)表明中風病人能夠從雌激素替代治療中獲益，此外，長期使用雌激素替代治療會增加老年中風高危患者乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等疾病的風險，因此，植物類雌激素逐漸引起了眾多學者的關注。植物雌激素與哺乳動物雌激素具有相似的分子結構，能夠通過結合并激活雌激素受體而發(fā)揮弱雌激素樣神經(jīng)保護作用，而不良反應少見[14]。補陽還五湯是治療中風后遺癥的經(jīng)典名方，臨床療效較肯定，但其促神經(jīng)功能恢復的機理尚未完全明確[5]。課題組前期研究證實該方能促進缺血腦內(nèi)NSCs增殖，提高海馬新生神經(jīng)元數(shù)量，增加去勢腦缺血大鼠雌二醇水平和雌二醇受體的表達，減少腦梗死體積，具有類雌激素作用[6,15]。本研究結果表明補陽還五湯能夠促進去勢腦缺血雌性大鼠右側海馬DG區(qū)NSCs增殖及pERK1/2、pCREB1的表達，且效果優(yōu)于戊酸雌二醇，同時能被GPER-1的特異性阻斷劑G15部分逆轉，進一步說明本方具有類雌激素作用，而通過調(diào)控ERK/CREB通路活性是其作用的分子機制。

綜上所述，補陽還五湯可以促進去勢腦缺血雌性大鼠缺血側海馬DG區(qū)神經(jīng)干細胞增殖，具有類雌激素作用；通過上調(diào)缺血側海馬DG區(qū)ERK1/2、CREB1的磷酸化水平,激活ERK/CREB信號通路，可能是其發(fā)揮類雌激素作用、促進內(nèi)源性神經(jīng)再生、修復受損的神經(jīng)功能的作用機制之一。

[1]Mu Q,Liu P,Hu X.Neuroprotective effects of Buyang Huanwu decoction on cerebral ischemia-induced neuronal damage[J]. Neural Regen Res,2014,9(17):1621-1627.

[2]Shimada K,Kitazato KT,Kinouchi T,et al.Activation of estrogen receptor-α and of angiotensin-converting enzyme 2 suppresses ischemic brain damage in oophorectomized rats[J].Hypertension,2011,57(6):1161-1166.

[3]Lim S,Moon M,Oh H,et al.Ginger improves cognitive function via NGF-induced ERK/CREB activation in the hippocampus of the mouse[J].J Nutr Biochem,2014,25(10):1058-1065.

[4]Frick KM,Kim J,Tuscher JJ,et al.Sex steroid hormones matter for learning and memory:estrogenic regulation of hippocampal function in male and female rodents[J].Learn Mem,2015,22 (9):472-93.

[5]劉柏炎，沈劍剛，蔡光先，等.補陽還五湯對局灶性腦缺血大鼠腦內(nèi)caveolin1、2的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2008，28(01)：22-24.

[6]Liu BY,Song X,Yi J,et al.Buyang Huanwu Decoction(補陽還五湯)reduces infarct volume and enhances estradiol and estradiolreceptorconcentrationinovariectomizedratsafter middle cerebral artery occlusion[J].Chinese Journal of Integrative Medicine,2014,20:782-786.

[7]Zeynalov E,Rezvani N,Miyazaki C,et al.Reproductive Senescence Blunts Response of Estrogen Receptor-α Expression to Estrogen Treatment in Rat Post-Ischemic Cerebral Microvessels [J].PloS one,2014,9(7):e102194.

[8]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke, 1989,20(1):84-91.

[9]Chou J,Harvey BK,Chang CF,et al.Neuroregenerative effects of BMP7 after stroke in rats[J].Journal of the Neurological Sciences,2006,240(1):21-29.

[10]Dennis M K,Burai R,Ramesh C,et al.In vivo effects of a GPR30 antagonist[J].Nature Chemical Biology,2009,5(6): 421-427.

[11]Zhang D,Xia H,Xu L,et al.Neuroprotective effects of 17βestradiol associate with KATP in rat brain[J].Neuroreport, 2012,23(16):952-957.

[12]Lappano R,De Marco P,De Francesco EM,et al.Cross-talk betweenGPERandgrowthfactorsignaling[J].JSteroid Biochem Mol Biol,2013,137:50-56.

[13]Jover-Mengual T,Zukin RS,Etgen AM.MAPK signaling is critical to estradiol protection of CA1 neurons in global ischemia[J].Endocrinology,2007,148(3):1131-1143.

[14]Westmark CJ.A hypothesis regarding the molecular mechanism underlying dietary soy-induced effects on seizure propensity[J]. Front Neurol,2014,5:169.

[15]劉柏炎，蔡光先，陳雪梅，等，補陽還五湯對大鼠局灶性腦缺血神經(jīng)再生的影響[J]，中華神經(jīng)醫(yī)學雜志2007，6（8）：762.

（本文編輯 楊 瑛）

Effects of Buyang Huanwu Decoction on Neural Stem Cells Proliferation and ERK/CREB Signaling Pathway in Hippocampus after Cerebral Ischemia in Ovariectomized Female Rats

HUANG Xin1,ZHOU Shengqiang2,LIU Shengxian1,ZHANG Bichao1,XUE Kehui1,LIU Baiyan1，2*
(1.Yiyang Medical College,Yiyang,Hunan 413000，China;2.Hunan University of Chinese Medicine, Changsha,Hunan 410208，China)

ObjectiveTo investigate the effects of Buyang Huanwu Decoction on neural stem cells(NSCs)proliferation and ERK/CREB signaling pathway in hippocampus after cerebral ischemia in ovariectomized female rats.Methods The ovariectomized female rats with cerebral ischemia model was established by the methods of ovariectomy（OVX）and middle cerebral artery occlusion(MCAO).The 36 rats were randomly divided into 6 groups,double sham-operation group,compound model group,estrogen group,estrogen+G15 group and Buyang Huanwu Decoction group and Buyang Huanwu Decoc tion+G15 group,6 rats in each group.The rats were given corresponding medicine intragastric administration for 14 days from 24 hours after operation,at the same time,BrdU and G15 were intraperitoneal injected to label the proliferation cells and block GPER-1 in each day,respectively.The NSCs proliferation of ischemic hippocampal dentate gyrus in rats was detected using immunofluorescence BrdU/nestin double staining with paraffin sections,the SP method of immunohistochemistry was used to detect the expression levelofERK1/2,CREB1phosphorylationprotein.ResultsComparedwiththecomposite model group,the number of double positive cells and pERK1/2,pCREB1 positive cells in ischemic hippocampal DG area of Buyang Huanwu Decoction group and estrogen group were increased(P＜0.05),but the indicators in Buyang Huanwu decoction group were higher than estrogen group(P＜0.05).Compared with Buyang Huanwu Decoction group,the numberof double positive cells and pERK1/2,pCREB1 positive cells in ischemic hippocampal DG area of Buyang Huanwu Decoction+G15 group were decreased(P＜0.05).ConclusionBuyang Huanwu Decoction can promote ischemic hippocampal NSCs proliferation in ovariectomized female rats after cerebral ischemia,and to activate ERK/CREB signaling pathway,which may be one of the mechanism of its estrogen-like effect and endogenous neurogenesis.

cerebral ischemia;neural stem cells;ERK/CREB signaling pathway;OVX rats;Buyang Huanwu Decoction

R285.5

A

2016-05-20

國家自然科學基金項目（81273989）；湖南省教育廳一般項目（14C1131）；湖南省科技廳一般項目（S2014F1023）；益陽市科技廳一般項目（YK1541）。

黃昕，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：心腦血管疾病研究。

*劉柏炎，男，博士，教授，博士研究生導師，Email:liubaiyan@126.com。